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Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.: ELFATOCHEMS.A. IO-Nov-95 95/SAE6/1205/HT AR226-3032 Acute Toxicity to Daphnia Author(s): H. Thiebaud Coll. P. Brochier English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions Enterprise 27-Jan-03 TECHNICAL SUMMARY r ^ ^ ^ ^ ^ b^||mf----HOver Determination of acute toxicity (inhibition of mobility) of Daphnia magna 24 and 48 hours was effected using the operating procedure described in standardlS06341 applicableto chemical substances, industrial and urban effluents, to surface and subterranean waters. This method differs from method C.2 in appendix II of the European directive 92/69/EEC since it does not require that the nominal concentrations of the substance be verified by analysis. The method consists in exposing the daphnias to a range of concentrations of the substance being studied. The toxic effect observed is the immobilization at the end of 24 and 48 hours. From the dose/effect relation established with the initial concentrations, a median effective CE(l)so is calculated, expressed as CE(l)so - 24 h and CE(l)so - 48 h. Under the study conditions||--------------W}resentasCE(l>5o- 24 h which is above the highest concentration tested (200 mg/l) and CE(l)so" 48 h of 100 mg/l with a confidence interval at 95 % = 95mg/lto110mg/I. 2rSIiNftTURE Director of the study: H. THIEBAUD Date Signature 12/11/95 Technician who carried out the study: P. BROCHIER Date Signature 16/11/95 ElfAtochemS-A. DCRD Centre d'Application de LevalEois Service Analyse Environnement LevaHois, Ie 10/11/95 Reference: 95/SAE6/1205/HT Sequentiel: 814020 RAPPORT D'ETUDE I, TITRE : |f------B0~OXiCITEAIGUE VIS-A-VIS DES DAPHNIES AUTEUR(S): H. THIEBAUD ; Coll. P. BROCHIER RESUME DOCUMENTAIRE : Deteroainationdelatoxicite aigue (inhibition de la mobilite) de Daphnia magna par leJMBHHHHHfur 24 et 48 heures, en suivant Ie mode operatoire decrit^ans la norme IS(T6341 (seconde edition, 1989). .MOTSCLES: bxicite aigue daphnies, ISO 6341. DESTINATAIRES : M. DEVAUX (DCFS) DOC FICHIER TECH (M. TAISNE) Copies : Chef de Service, Responsable des Archives, Secretariat, Service Ecotoxicite et Surete des Produits (DSE-P) . aQ W^- y^j Ce daaitnentestnotlGpmpriSS. InepeutetKrscopiS, ri communique d des Sets sans autorisaSon expresse <S3fiSochem. i not gor.fain TSCACB? 2/13 RESUME TECHNIQUE 'fSmmmisva-24 La determination deja toxicite aigue (inhibition de la mobilite) de Daphnia magna par Ie et 48 heures a etc realisee en suivant Ie mode operatoire decrit dans lanonne ISO 6341 applicable aux substances chimiques, aux effluents industriels et urbains, aux eaux de surfaces et souteiraines. Cette methode differe de la metnode C.I de I'annexe II a la directive europeenne 92/69/CEE car elle ne necessite pas que les concentrations nominales en substance soient verifiees par analyse La me&ode consiste a exposer les daphnies a une gamme de concentrations de la substance etudiee. L'effet toxique observe est 1'unmobilisation au bout de 24 heures et 48 heures. A partir de la relation dose/efiet etablie avec les concentrations mitiales, on dedmt une concentration mediane effective CEQso, exprimee en (1)50 - 24 h et (1)50 -TSE. Dans les conditions de I'etude, lelEIHHHBHqP1*65'1^ une CE(I)5g - 24 h superieure a la plus forte concentration testee (200 mgf^et une CE(I)so - 48 h de 100 mg/I avec un intervalle de confiance a 95 % de 95 nig/I a 110 mg/1. Le Directeur de I'etude : H. TH3EBAUD Date ^/l(/^ s Signatu La Technicienne chargee de I'etude: P. BROCHTER Date k ^M}^ Signature Ce documentestnotns pmpri6t6.InepeutehenicopS, niconmuniquS S desfeissans autonsaSon expresse dBfAtoctiem. nog coBfaIn TSCA CBj 3/13 RAPPORT D'ETUDE SOMMAIRE 1. IDENTIFICATIONS ------------------ 4 1.1. Substance d'essai 4 1.2. Laboratoire d'essai 4 1 ;3: Demandeur de-fetude 5 1.4. Calendrier 5 2. OBJECTIF DE L'ETUDE 5 3. METHODE D'ESSAI 5 3.1. Introduction 5 3.1.1. Principe 5 3.1.2. References 6 3.1.3. Deviations 6 3.2. Materiel et produits 6 3.2.1. Materiel 6 3.2.2. Produits et reactifs 6 3.3. Mode operatoire 7 3.3.1. Preparation des solutions 7 3.3.2. Essai preliminaire 7 3.3.3. Methode d'analyse 7 3.3.4. Essai definitif 7 _ 3.3.5. Controle de.sensibilite du reactif biologique 7 4.RESULTATS 7 4.1. Essai definitif 7 4.2. Criteres de Validite de I'etude 8 4.2.1. Teneur en oxygene 8 4.2.2. Immobilisation des temoins 8 4.2.3. Sensihilite du reactif biologique 8 5. CONCLUSIONS 9 6. ANNEXES 10 6.1. Annexe 1 Milieu d'essai. 10 6.2. Annexe 2 Concentrations utiiisees et resultats des calculs a 24 heures 11 6.3. Annexe 3 Concentrations utiiisees et resultats des calculs a 48 heures 12 Csmpany Sanitized, not contain TSCA CB|J Ce documentestnoire pmprieS. llnepeutSfre nicopK, ri' comnvrsfi6 ^ des Ses sans autarisaSon expresse cfBfAtocfiem. RC26349.DOC page 3/13 1. IDENTIFICATIONS 1.1. SUBSTANCE D'ESSAI Denomination iPBHHl N d'enregistrement|BHB| J Caracteristiques principales: - apparence : Hquide brun - solubilite dans 1'eau: totalement soluble Precaution d'emploi et de conservation: voir la FDS 1.2. LABORATOIRE D'ESSAI ELF ATOCHEM CENTRE D'APPLICATION DE LEVALLOIS SERVICE ANALYSE ENVIRONNEMENT 95 me Danton 92300 LEVALLOIS-PERRET Directeur d'etude M. TfflEBAUD Personnel implique dans 1'etude Ingenieur: Technicienne : M. THIEBAUD Mile BROCHIER Ce document est notre pmpriSte.I ne peut ate ri copK, li conimuraqu^ d dss Sets sans autonsation expmsse dBfAtochern. o/^nff-y^n r^rv^ r^,^w^ ^/-fo 5/13 1.3. DEMANDEUR DE L'ETUDE M. DEVAUX (DCFS) 1.4. CALENDRBER Debut de I'etude Fin de 1'etude Rapport d'etude 2/10/95 11/10/95 10/11/95 2. OBJECTTF DE L'ETUDE L'objectif de cette etude _est de determiner laJ:oxicite aigue (inhibition de la mobilite) vis-a-vis des daphnies duyHBIHHHHB611 suivant Ie mode operatoire decrit dans la norme ISO 6341 (seconde edition, 1989^Cette nonne s'applique aux substances chimiques, aux effluents industriels et urbains, aux eaux de surfaces et souten-aines. 3. METHODE D'ESSAI 3.1. INTRODUCTION 3.1.1. PRINCIPE - - Les daphnies sont exposees a la substance d'essai ajoutee a 1'eau, dans une serie de concentrations donnee, pendant une periode de 24 heures et eventuellement 48 heures, sans renouvellement des concentrations d'essai. Dans des conditions identiques et pour une gamme de concentrations adequate (definie au moyen d'un essai preliminaire), des concentrations differentes en substance d'essai ont des effets dijBFerents sur la capacite de nage des daphnies. En consequence, en fin d'essai, a chaque concentration correspond un pourcentage different d'immobilisation des daphnies. Les concentrations initiales provoquant 0 et 100 % d'immobilisation sont detenninees directement par 1'observation. La concentration initiale efficace inhibitdce unmobilisant en 24 heures 50 % des daphnies mises en experimentation, designee CE(I)5o - 24 h, est detenninee par calcul. La CE(I)5o - 48 h est eventuellement detenninee par la meme methode. L'etude est conduite en deux etapes : - un essai prelmunaire qui sert a determiner la gamme des concentrations pour 1'essai definitif. - un essai definitif dont seui Ie resultat est retenu : CE(I)5o - 24 h et eventuellement CE(I)5o - 48 h. Ce document est noire pmpriefS.Inepeut are ni copK, ni cornrmnkiuS S des Hers sans autoiisaSan expfesse dEfAtochem. Sanjfeecj. Does not contain TSCA i 6/13 On constate au cows de 1'essai preliminaire, que seule la concentration 100 mg/1 montre une toxicite pour les daphnies significative apres 48 heures. Un essai defintif est realise dans la gamine de concentration : 53,9 a 200 mg/1. ,,___________IBftant un melange de plusieurs substances pouvant evoluer differemment, les resuffars sont exprimes par rapport aux concentrations nominales (mg/1)de la preparation, considerees equivalentes aux concentrations initiales. Les pourcentages d'immobilisation en fonction des concentrations mitiales, a 24 et eventuellement 48 heures, sont utilises pour calculer, a 1'aide d'un programme informatique approprie, la CE(I)5o (a 24 heures et eventuellement 48 heures). Les intervalles de confiance a 95 % sont, si possible, determines par Ie calcul. 3.1.2. REFERENCES - Norme Internationale ISO 6341, Qualite des eaux - Determination de rinhibition de la mobilite de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), seconde edition du 01/10/89. 3.1.3. DEVIATIONS 3.2. MATERIEL ET PRODUITS 3.2.1. MATERIEL L'etude a ete realisee dans une salle thermostatee a une temperature comprise entre 20 et21C. Les parametres physico-chimiques ont ete mesures au moyen multifonctions JENWAY 3410 (oxymetre, conductimetre, pHmetre). d'un combine Les daphnies {Daphnia magna Straus) utilisees proviennent d'un elevage realise dans Ie laboratoire. La selection d'organismes ages de moins de 24 heures s'effectue par tamisage (toile a bluter a mailles de 0,56 mm). La composition du milieu d'essai est detaillee en annexe 1. Les recipients pour essai sont des bechers de capacite nominale de 250 ml. 3.2.2. PRODUITS ET REACTIFS - Eau : pour la preparation des solutions meres du milieu d'essai, il est fait usage d'eau ultrapure (ultrafiltration, charbon actif, echange d'ions, filfire 0,22 urn); de meme, pour Ce document est noire proptiete. Inepeut 8re ni copK, ni communique A des Seis sans aufcmsalion expresse cfBfAtachem. .OoesnoteoReaW 7/13 la realisation du milieu d'essai (eau de dilution) les solutions meres sont diluees dans de 1'eau ultrapure. - Les reactifs utilises pour la preparation de 1'eau de dilution (voir annexe 1) sont de qualite "pour analyse". 3.3. MODE OPERATOIRE ^^^^^^^^ 3.3.1. PREPARATION DES SOLUTIONS Une solution def--------1------jdanIse milieu d'essai a 100 mg/1 est preparee Ie jour de I'essai preliminaire, et a 200 mg/1 Ie jour de I'essai definitif. 3.3.2. ESSAI PRELIMINAIRE ^ Des volumes adequats de la solution mere d^lHBlHHUw0111 yerses dans les recipients et completes a 200 ml par de I'eaTde dilution pour^rotenirla gamine de concentrations allant de : 0,1 a 100 mg/1 10 daphnies agees de moms de 24 heures sont ajoutees dans chaque recipient d'essai puts ceux-ni sont places a 1'obscurite dans la salle thermostatee. Au bout de 24 heures, les daphnies encore mobiles sont denombrees, bechers sont replaces a 1'obscurite puts un deuxieme denombrement est realise 48 heures apres Ie debut de I'essai. Les resultats obtenus servent a definir la gamme de concentration de I'essai definitif. 3.3.3. ESSAI DEFINITIF On precede a des dilutions de la solution mere dans de 1'eau de dilution pour realiser la gamme de concentrations necessaire a la realisation de I'essai definitif. Les differentes concentrations de cette gamme sont donnees dans les annexes 2 et 3. 2 bechers de 10 daphnies agees de moins de 24 heures sont prepares pour chaque concentration et pour Ie temoin. Au bout de 24 heures, les daphnies encore mobiles sont denombrees, les recipients sont replaces a 1'obscurite puts un deuxieme denombrement est realise 48 heures apres Ie debut de I'essai. 3.3.4. CONTROLE DE SENSIBILITE DU REACTIF BIOLOGIQUE Periodiquement, et selon Ie meme mode operatoire, la CE(I)5o - 24h du dichromate de potassium est determinee afin de controler la sensibilite des organismes. Ce document esfnotre pmpriSK. Ine peutStB nicopK. ni communiquS a des eelssansautorisafon expfesse dBffitochem. Of">fV>/iQ riFlf nanQ 7/11 8/13 4. RESULTATS 4.1. ESSAI DEFINITIF Les resultats obtenus dans 1'essai sont rassembles dans les tableaux en annexe 2 (resultats a 24 heures) et en annexe 3 (resultats a 48 heures). La parde superieure montre les donnees brutes obtenues ; les concentrations utilisees pour les calculs sont indiquees en dessous. Apres linearisation au moyen de la mefhode des Probits, on obtient les resultats suivants : Apres 24h, la plus forte concentration testee (200 mg/1) ne montre pas de toxicite significative du FORAFAC 1157 N vis-a-vis des daphnies. La CE 5o-24h est done superieure a cette concentration; Apres 48h, les resultats permettent Ie calcul d'une CE 5o-48h egale a 100 mg/1, avec mi intervalle de confiance a 95 % egal a: 95 -110 mg/1 (r2 = 0,981). Le pH initial a la concentration la plus elevee etait de 7,66. Le tableau ci-dessous donne les resultats des mesures d'O; et de pH realisees aux differentes concentrations : Concentration nominale (mg/1) 02 a 48h (mg/1) pH a 48 h 0 8,5 7,72 53,9 8,4 7,67 70,0 8,3 7,63 91,0 8,3; 7,65 118,3 8,2 7,65 153,8 8,3 7,65 200 8,2 7,61 4.2. CRITERES DE VALIDITE DE L'ETUDE 4.2.1. TENEUR EN OXYGENE A chaque concentration, la teneur en oxygene dissous, mesuree en fin d'essai, est superieure ou egale a 2 mg/1. 4.2.2. IMMOBILISATION DES TEMOINS L'iminobilisation au bout de 48 heures dans la'serie temoin est de 5 %. La clause requerant une mortalite inferieure ou egale a 10 % en fin d'essai a done ete respectee. 4.2.3. SENSIBILITE DU REACTIF BIOLOGIQUE Le demier controle de la sensibilite des daphnies au dichromate de potassium a ete realise le 06/09/95. La CE(I)5o - 24 h de cette substance de reference, evaluee a 0,94 mg/1, etait comprise entre 0,9 mg/1 et 2,4 mg/1 qui est la gamme acceptable ( 9.2 de la norme ISO 6341). CGanySaolfeeADeesMc Ce document est noire pmprie^t.eIn. epetrte^nimpS.nicornrwniqueadeslsrssansautorisalionexprBssedBfMochem. "Wft FSCA I 9/13 5. CONCLUSIONS L'etude de la toxicite aigue d^u|^|B^----------------|qlds-a-vdeisla daphnie cette substance presente une CE(l)5o- 24 h superieure a 200 mg/1 et une CEmdo)n^tr-e4q8uhe egale a 100 mg/1 avec un intervaUe de confiance a 95 % de 95 mg/1 a 110 mg/1. CedacunientestnotrBpmpriiSteI.nepeuteiiBricopS, nicanmn^6Sc^lwsarsautatsalionexpiBsseifBfAtocfieiTi. or'iRiAa r\r\r' nsrm a/ii 10/13 6. ANNEXES 6.1. ANNEXE I: MILIEU D'ESSAI. L'eau de dilution (ou milieu d'essai) est preparee de la fayon decrite dans la norme ISO 6341: - les solutions meres suivantes sont preparees : 11,76 g de CaClz, 2H20 par litre d'eau ultrapure, 4,93 g de MgSC>4,THzO par litre d'eau- ultrapure, 2,59 g de NaHC03 par litre d'eau ultrapure, 0,23 g de KC1 par litre d'eau ultrapure. - 1'eau de dilution est obtenue a partir de 25 ml de chacune de ces solutions par litre d'eau, puts aeration jusqu'a saturation en oxygene. Ce document est note prnptiSS. line peutStiB ncapS, ncomniuniquS a des Seissans autorisaSon expresse dEffitochem. 11/13 6.2. ANNEXE 2 : CONCENTRATIONS UTCLISEES ET RESULTATS DES CALCULS A 24 HEURES TOXICrrt AIGUE VIS-A-VIS DES DAPHNIES Calcul de la CE50 par la miSthode du Probit Echantillor n d'etude :T6349/95/A Methode appliquee :|1S06341 Essai definitif, 24 heures D[Daapphhnnies par concentration: 20 Cone.en substance Nombre de daphnies mobiles mgtt 200 % IMMO 10 Recipient 1 10 ----- Recipient 2 8 R- ecipient 3 Recipient 4 total 18 153,8 0 10 10 20 118,3 0 10 10 20 91 5 9 10 19 70 5 9 10 19 53,9 0 10 10 20 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 0 (temoin) 0 10 10 20 0 (solvant) 100 0 Ce document est noire pmptiete. llnepeutetm nf'copS. ra'communique a des Seissans autonsaSon exptesse dBFfitochem. 12/13 6.3. ANNEXE 3 : CONCENTRATIONS UTILISEES ET RESULTATS DES CALCULS A 48 HECBES TOXICnt AIGUE VIS-A-VIS DES DAPHNIES Calcul de la CE50 par la m6thode du Probit Echantillon n0 d'etude H6349/95/A Methode appliquee :|ISO 6341 Cone. en substance mg/l 200 153,8 118,3 91 70 53,9 0 (temoin) 0 (solvant) EssaE deflnttif, 48 heures Daphnies par concentration: 20 % IMMO 95 75 60 45 20 5 100 100 100 100 100 5 100 Recipient 1 1 3 4 5 8 9 Nombre de daphnies mobiles Recipient 2 Recipient 3 Recipient 4 0 2 4 6 8 10 9 10 CE50 = CE 50 > CE50< r2 = 100 95 110 0,981 mg/l mg/l mg/l Donnees utilisees pour Ie calcul concentration 200 153,8 118,3 91 70 53,9 % IMMO 95 75 60 45 20 5 nb valeurs 6 #N/A: valeur non disponible. #NOMBRE!: valeur indeterminee. % IMMO corrigee 95 75 60 45 20 5 SM/A #N/A #N/A #N/A Somme Moyenne PROBIT log cone. y x 6,640 2,301 5,670 2,187 5,250 2,073 4,870 . 1,959 4,160 1,845 3,360 #N/A 1,732 iSPNOMBRE! #WA #NOMBRE! #N/A #NOMBRE! #WA #NOMBRE! 29,950 12,097 4,992 2,016 total 1 5 8 11 16 19 0 0 0 0 0 19 0 Ce documentesfnote prnpriSS.tnepeutetre nicopfe recommunique a des tens sans autorisafon expresse (fBAtochem. 13/13 Calcul de la CE50 i 48h selon la m6thode du Probit 7,000 Valeurs experimentafes Droite calculee 4- 6,000 5,000 g 4,000 I 3,000 - I 2,000 -J- 1,000 I 0,000 0,500 1,000 1,500 log decimal de la concentration 2.000 0,000 2,500 Ce document estnofreprepnSte. InepeutSlie nicopK, ncomnunkfuSS desists sans autorisafon exptssse ifSAtochem. sontain TSCA cm