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AR226-3010 Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.: ELF ATOCHEM 06-Mar-05 59198 Determination of Bacterial Inhibition in Pseudomonas Putida Author(s): H. Thiebaud Coll A.M. Petit - English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions. Enterprise 27-Jan-03 not contain TSCA CBS; ELF ATOCHEM Levallois Applications Center TECHNICAL SUMMARY Determination of growth inhibition of Pseudomonas putida bacteria b^ using the operating procedure described in proposed standard ISO/DIS '12 (c f.d o d i effected T90B). The method consists in exposing the bacteria for 16 hours to a range of concentrations of the substance being studied. The inhibiting effect observed on Pseudomonas putida is determined by comparing the cell growth at various dilutions of the substance with the ceil growth obtained for a culture under the same conditions but which does not contain the test substance. The ceil growth is determined by turbidimetry using a spectrophotometer. The percent cell growth inhibition H is given by the relation : H = ((Bk - Bn)/(Bk - B0))x100 where Bk and Bn are the turbidities, respectively, in the control and test flasks (after deduction of non' inoculated whites) and BO is the turbidity at|t = 0 in the control flasks. Under the test condition! iresents a : CES0 - 1 6 h = 18 mg/l, with a confidence interval at 95 % = 14 - 24 mg/l and a CE10 - 1 6 h = 5.5 mg/l, with a confidence interval at 95 % = 3 - 8.1 mg/l The reference s u b s t a n c e ^ & ' !as a CE50 - 1 6 h equal to 16 mg/l and a C E 10 - 1 6 h equal to 10 mg/l The validity criteria mentioning that the inoculum used in the control grew by at least a factor of 60X for the duration of the test was respected (growth factor = 127). A. M. PETIT H. THIEBAUD Translation : Language Services Running Fox Technologies, Inc. A. Z. Fresco : 1/24/03 Cawtsesjf Sanitized. Does noi contain TSCA CBI ELF ATOCHEM D.C.R.D. Centre d'Application de Levallois Service Analyse Environnement Levallois le : 06/03/95 Rf. document : 58198 N de Squentiel : 814020 TITRE : DTERMINATION DE L'INHIBITION DE LA CROISSANCE DES BACTRIES PSEUDOMONAS PUTIDA AU TEU R (S) : H. THIBUD Coll. A. M. PETIT RSUM DOCUMENTAIRE : r w n r r njnatinn h p l'inhhtinn de la croissance des bactries Pseudomonas putida par iJ K m s n suivant le mode opratoire dcrit dans la mthode du projete norme ISO/DIS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). Inhibition de la croissance des bactries Pseudomonas putida; DESTINATAIRE : M. BLANDEL (DCFS) Ce rapport comprend 3 pages et 6 feuillets non pagins (feuilles de saisie, de calcul et reprsentation graphique) Copies : Chef de Service, Responsable des Archives, Laboratoire d'cotoxicologie (copie coll.) Secrtariat, Fichier TECH Service cotoxicit et Sret des Produits (DSEP) Ce document est la proprit d'E L F A T O C H E M . Il ne peut tre ni copi, ni communiqu des tiers sans autorisation formelle. La reproduction de ce rapport d 'tude n'est autorise que sous forme de fac-simil photographique intgral. REPS4820.DOC Page 1/3 ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levaliois RSUM TECHNIQUE La rioterminafinn de l'inhibition de la croissance des bactries Pseudomonas putida par t ralise en suivant le mode opratoire dcrit dans le p r o j e t d ^ ^ ^ ^ ^ ^ D l n 0 7 12 (cf. doc 118 Afnor T90 B). La mthode consiste exposer pendant 16 heures les bactries une gamme de concentrations de la substance tudie. L'effet inhibiteur sur Pseudomonas putida est dtermin par comparaison de la croissance cellulaire des diverses dilutions de substance avec la croissance cellulaire obtenue pour une culture ralise dans les mmes conditions mais ne contenant pas de substance d'essai. La croissance des bactries est mesure par turbidimtrie avec un spectrophotomtre. Le pourcentage d'inhibition de la multiplication clifilaire, H, est donn par : H = ((Bk-Bn)/(Bk-B0))x100 avec Bk et Bn, Jes-iurJaidits^esp^ctivement dans les flacons tmoins et dans les flacons d'essai (aprs dduction des blancs non inoculs) et BO, la turbidit t = 0 dans les flacons tmoins?------------------------------------- - - .." Dans les conditions de l'tude, l e h H ^ ^ ^ ^ | 0 p r s e n t e une : CE 50-16h = 18 mg/l, avec un intervalle de confiance 95 % gal 14 - 24 mg/l, et une CE -jo-16 h = 5,5 mg/l, avec un intervalle de confiance 95 % gal 3 - 8,1 mg/l. La substance de rfrence, le^ 16 mg/l et une C'E.'t0-16 h gale 10 mg/l. prsente une CE so-16h gale Le critre de validit mentionnant que l'inoculum utilis dans le tmoin s'est multipli par au moins un facteur 6 0 pendant la dure de l'essai a t respect (facteur de croissance = 127). Ce documen! est la proprit d'ELF A T O C H E M . Il ne peut tre ni copi, ni com m uniqu s des tiers sans autonsation formelle La reproduction de ce rapport d'tude n'est autorise que sous forme de fac-simii photographique integral REPS4820.DOC Page 2/3 Gonpany Sanitized. Donot contain TSC r.m ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levallois ESSSAI D` INHIBITION DE LA CROISSANCE ` DE PSEUDOMONAS PUTIDA netncae decrre dans le orojet 3& nonre ISO/DIS "0712, cf ooc 1 S Afnoi T 30 B) Substance tudie Nom j__ _ Rfrence CAL : 4820/94 Substance de rfrence Nom Rfrence CAL (lot) : Aldrich 97% 633 Demandeur de l'tude : Directeur de l'tude : Ralisation technique : Date du dbut de l'essai : Date de la rdaction du rapport d'tude : M. BLANDEL (DCFS) H. THIBAUD A. M. PETIT 16/11/94 06/03/95 Prparation de l'chantillon : Le jour de l'essai, une solution mre 500 mg/l dans le milieu d'essai est Droare. Mesures des pH : Concentration Oroamisme test : 0 mg/l 100 mg/l pH en dbut d'essai 6,95 6,90 pH en fin d'essai 6,01 5,90 Pseudomonas putida ; Institut PASTEUR 103281 Matriel : Gamme de concentrations : . Verrerie strilise (Erlens de 10 ml) Spectrophotomtre Perkin -Elmer lambda 5 Agitateur thermostat 21 C +/-1 C Solution mre ou solution mre dilue de la substance (facteur de dilution entre parenthses) Eau Milieu d'essai Inoculum r V o l u m e (ml ) 2 1 0,5 2,5 1,25 (1/10) 1/10) 6 7 7,5 5,5 6,75 11111 1 1 1 1 `1 Concentration (mg/l) 100 50 25 12,5 6,25 0 8 1 1 0 Ce document est la proprit d'E LF A T O C H E M . Il ne peut tre ni copi, ni communiqu des tiers sans autorisation formelle. La reproduction de ce rapport d'tude n'est autorise que sous forme de fac-simil photographique intgral. REPS4820.DOC Page 3/3 CsKjiM y Sanitized. Does not contain TSCA CBS 1 Fcc?i d'inhibition de ia croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h Mthode dcrite dans le projet de norme ISO/DIS 10712 Feuille de saisie des mesurages Substance tudie : Nom : __ Rf. CAL : 4820/93 Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Turbidit de la prculture nombre de absorbance mesure (A436) 1 2 3 moyenne #DIV/0! FNU #N/A #N/A #N/A #DIV/0! Inoculum dans le tmoin Concentration initiale (% vol) : Turbidit initiale BO (A 43B) : Facteur de croissance observ pendant la dure de l'essai : 10% 6,4 127 Concentration Mesuraae de l'absorbance (A436 ) en fin d'essai dans les sries d essai et le tmoin (mg/l) 0 (tmoin) 6,25 12,5 25 50 100 facteur de dilution 0,04 0,05 0,05 0,05 0,10 1,00 Essais 1 0,120 0,150 0,119 0,048 0,069 0,116 2 0,125 0,125 0,104 0,041 0,052 0,104 3 0,116 0,134 0,079 0,041 0,064 0,125 4 0,122 5 0,135 6 - Com pany Sanitized. Does not contain TSCA CB! 2 Fcggj d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h Mthode dcrite dans le pro|et de norme ISO/DIS10712 Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la mthode des Probits ________________ _ Substance tudie : Souche de Pseudomonas putida : institut Pasteur 103281 Concentration (mg/l) 0 (tmoin) 6,25 12,5 25 50 100 #N/A N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0,124 0,136 0,101 0,043 0,062 0,115 #N/A N/A #N/A Turbidit moyenne (FNU moy) 810 710 530 240 170 30 #N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 12,4 34,8 70,9 79,6 97,1 #N/A #N/A #N/A CE50 = CE50 > CE50 < CE10 = CE10 > CE10 < r2 = 18 14 24 5,5 3 8,1 0,980 mg/i mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l #N/A : valeur non disponible. | NOMBRE! : valeur indtermine. Donnes utilises Dour le calcul (excluant le binme 0;0 du tmoin) Concentration Inhibition (mg/l) (%) corrige PROBIT y log cono. X 6,25 12,5 25 - 50 100 12,4 34,8 70,9 79,6 97,1 (%) 12,4 34,8 70,9 79,6 97,1 #N/A N/A N/A #N/A 3,820 4,590 5,520 5,810 6,880 N/A N/A #N/A #N/A 0,796 1,097 1,398' 1,699- 2,000 #NOMBRE! #NOMBRE! #NOMBRE! NOMBRE! nb valeurs 5 Somme Moyenne 26,620 5,324 6,990 1,398 t U Com pany Snifz@<. Boes not contain TSCA CB! 3 Probit de la proportion inhibe en fonction du logarithme dcimal de la concentration m Valeurs exprimentales -- Droite calcule 0,000 0,500 1,000 1,500 Logarithme dcimal de la concentration - - 3,000 - - 2,000 -- 1,000 2,000 ! I ! i S iI Com pany Sanffzed. Bases rtof confain TSCA CBl 1 Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 18 h Mthode dcrite dans le projet de norme ISO/DIS 10712 Feuille de saisie des mesurages ----------- v ... Substance tudie : iv u m . Rf. CAL : SUBSTANCE DE REFERENCE -ALDRICH- Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Turbidit de la prculture nombre de absorbance mesure (A436) 1 2 3 moyenne #DlV/0! FNU #N/A #N/A #N/A #DIV/0! Inoculum dans le tmoin Concentration initiale (% vol) : Turbidit initiale B0 (A 43) : Facteur de croissance observe pendant la dure de l'essai : 10% 6,4 127 Concentration Mesuraoe de l'absorbance (A436 ) en fin d'essai dans les sries d essai et le tmoin (mg/l) 0 (tmoin) 10 15 20 25 30 facteur de dilution 0,04 0,04 0,07 0,10 0,20 1,00 Essais 1 0,125 0,115 0,063 0,119 0,117 0,021 2 0,116 0,133 0,096 0,126 0,164 0,035 3 0,122 0,097 0,066 0,122 0,166 0,035 4 0,125 5 0,135 6 Company Sanitized. Boas not contain TSCA CB? 2 Fcggj d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h Mthode dcrite dans le projet de norme ISO/DIS 10712 Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la mthode des Probits Substance tudie : Souche de Pseudomonas putida : institut Pasteur 103281 CE -ALDRiCH- Concentration (mg/l) 0 (tmoin) 10 15 20 25 30 #N/A #N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0,125 0,115 0,075 0,122 0,149 0,030 #N/A #N/A #N/A Turbidit moyenne (FNU moy) 810 750 300 320 190 8,7 #N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 7,5 63,5 61,0 77,2 99,7 #N/A #N/A #N/A CE50 = CE50 > CE50 < CE10 = CE10 > CE10 < r2 = 16 8,5 22 10 2 14 0,864 mg/i mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l #N/A : valeur non disponible. | #NOMBRE! : valeur indtermine. Donnes utilises pour le calcul (excluant le binme 0;0 du tmoin) Concentration Inhibition PROBIT log conc. (mg/l) (%) corrige y X (%) 10 7,5 7,5 3,520 1,000 15 63,5 63,5 5,330 1,176 20 61,0 61,0 5,250 1,301 25 77,2 77,2 5,740 - 1,398 30 99,7 99,7 7,330 1,477 #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! nb valeurs 5 Somme Moyenne 27,170 5,434 6,352 1,270 Qirsps^ S&nrofe. 0 es not contain TSC G SI 3 Probit de la proportion inhibe en fonction du logarithme dcimal de la concentration s Valeurs exprimentales ISUBSTANC FDP 8,000 Droite calcule "i-- 7,000 6,000 5,000 J s S 4,000 % 3,000 2,000 1,000 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 Logarithme dcimai de la concentration 1,400 1,600 Com pany S anitized. Does not contain TSCA CBI