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Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.:
ELF ATOCHEM
22-Apr-99 95/SAEK/0432/CKE
AR226-3120
Algae Inhibition
Author(s): Coll:
H. Thiebaud C. Kae'
English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions Enterprise 27-Jan-03
Pompany Sanitized. Does nolcon^nT^^
TECHNICAL SUMMARY
The determination of growth inhibition (chronic toxicity) of fresh water algae Pseudokirchneriella
S " 28692.
' ' wiously called Raphidocelis subcapitata and Selenastrum capriconutum) exposed to for 72 hours, was effected using the operating procedure described in standard NF EN
The method consists in exposing the algae to a range of
concentrations dissolved in
water. The toxic effect observed is inhibition of cell multiplication after 72 hours.
The study was carried out in 100 ml Erienmeyer glass flasks, closed with carded cotton packed in gauze, containing 50 ml of the test solution seeded with an alga suspension in sufficient quantity to obtain 104 cells/ml at the start of the test. The test flasks were incubated at 22.2 0.5C under continuous agitation and lighting. The alga concentration was measured each day of the test. Physical and chemical analyses were effected at the start and the end of the test.
The concentration of substance under study which causes a 50 % reduction, either of the growth (0^500) or of the growth (CEsor) is determined. The NOEC (No Observed Effect Concentration), which corresponds to the highest concentration tested which does not create a significant effect relative to a
control, is determined by a statistical analysis test (Dunnett test). The results of the study are:
Nominal inhibiting concentration and NOEC (mg/l)
Value
Cl at 95 %
Integral biomass
CEsob - 72 h
9.6
CE,ob - 72 h
2.4
NOECb
1.9
3-22 0.18-6
-
Growth rate
CEsor - 72 h
23
14-45
CRior - 72 h
4.6
NOECr
9.4
1.9-8
-
Cl: confidence interval ND: indeterminate
The study was carried out without analysis of the test solutions. Thus, the substance under study being a preparation composed of several water soluble components, the method of NF EN ISO 28692 was used rather than method C3 of the appendix to Directive 92/69/EEC. This method allows the study to be
carried out without analysis of the test solutions, expressing the results based on nominal concentrations.
The inhibiting and NOEC concentrations presented in the above table were calculated using nominal --a^=B.^- concentrations.
fc)
i^^P^.E'S'aiiiizeQ'. Uoes nol-scniain TSCA (;".)
Visual observations allowed verifying the appearance of the solutions at the beginning and the end of the test : the test solutions were clear, colorless and homogeneous during the test. No precipitation was observed at the end of the test. Microscopic examination showed that the appearance of the algae at the end of the test was normal compared to observations made on the control solution : monocellular algae in the form a moon crescent of average size 5-10 //m. The pH variation during the test in the control series was 0.52 units.
The validity criteria of the study were respected : the density ratio (R) measured in the control solution was greater than 16 (R = 71); the pH of the control solutions did not vary by more than 1.5 units during
the test.
The present study was carried out according to the Good Practice principles of the OCDE laboratory.
||^[anxJSanHizedD.oes not contain TSCA CSf
UT Atocnem O.A.
DCRD Centre d'Application de Levallois
Service Analyse Environnement
conformite aux BPL de I'OCDE delivree par Ie GIPC en date du 8/3/93. rsconduite Ie 27/11/98
Levaliois, Ie 22/04/99
Reference Sequential Etude numero :,
RAPPORT D'ETUDE
TITRE :
INHIBITION DE LA CROISSANCE DES ALGUES
AUTEUR(S) :
H. THIEBAUD ; Coll. C. KAE
RESUME DOCUMENTAIRE : Determination de I'inhibition de la croissance (toxicite chronique) du i ^Btivis-a-vis des algues d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata sur 72 heures, en suivant Ie mode operatoire decrit dans la norme NF EN 28692 (reproduisant integralement la norme ISO 8692). Cette etude est realisee conformement aux principes de Bonnes Pratiques de Laboratoire de I'OCDE.
MOTS CLES : (Toxicit0 chronique. algues, NF EN 28592
DESTINATAIRES : M. DEVAUX (DFO) DOC FICHIER TECH
Copies ' :
Chef de Service, Responssble ties Archives,
Secretariat, Service Ecotoxicite et Surete des Produits (DSEP)
Cs ,'aspor; comarena 2S seaes s'. 3 i'euilie:s ns.-> p33in5.
lGgWpaiySanilized. Does nol contain TSr^ "'
Ce daKjmEt es; ."de oropres. lireDS^ererec30ta.niconTniria^3ctelisssa'saLi;ac'ssii3neoresserf3fAto2rirn La resrorjsa-! os =e rsroon cferie n'es; auExsee oue SSLS ianre 05 ia^sms iroEnraonia-'e i.ntKSi.
'Sfjss n' 4285,'98/A - RC342S5.DOC pEge '.,'29
Centre d'Application de Levallois
RESUME TECHNIQUE
La determination de 1'inhibition de la croissance (toxicite chronique) des algues d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata (precedemment nominee Raphidocelis subcapilata
et Seiena.'itnim capricornutum) exposees audll----H----S pendant 72 heures, a ete
realisee en suivant Ie mode operatoire decrit dans la nonne NF EN 28692.
La methode consiste a exposer les algues a une gamme de concentradons du
C W R solubilise dans 1'eau de dilution. L'effet toxique observe est 1'inhibtion de la
l f R multiplication cellulaire au bout de 72 heures.
L'etude a ete realisee dans des fioles erienmeyer en verre de 100 ml, bouchees a 1'aide de coton carde emballe dans de la gaze, contenant 50 ml de solution d'essai ensemencee par une suspension d'algues en quantite suffisante pour obtenir 104 cellules/ml en debut d'essai. Les flacons d'essai ont ete incubes a 22,2 0,5 C sous agitation et eclairage
continu. La concentration algale a ete mesuree a chaque jour d'essai. Des analyses physico-chimiques ont ete realisees en debut et en fin d'essai.
La concentration en substance a etudier qui provoque une reduction de 50%, soit de la croissance (CE^ob), soit du taux de croissance (CEaor) est determinee. La NOEC (No Observed Effect Concentration) ou CSEO (Concentration Sans Effet Observe ), qui correspond a la plus forte concentration testee ne creant pas d'effet significatif par rapport au temoin, est par ailleurs determinee par une methode d'analyse statistique (test de
Dunnett). Les resultats de 1'etude sont:
Concentration nominale inhibitrice et NOEC (nig/I)
Valeur
1C a 95 %
Biomasse integraie
CE5ob-"2h
9.6
3-22
CEiob-72h
2.4
NOECb
1.9
0,18-6
-
'
CE50r-72h
Taux de croissance
23
14-45
CEionr,-72h
4-..06
NOEC..
9.4
1C : intervalle de confiance ND : non determine
'.9-8
CjBmpanySanitized. Does hot conta'"
Ce aoajmaTt ss rare Oi-xrisS. Bre peui ere re eapa, n c3'nrnunc?J a oss la's srs ajiofsann expresse rf3" kwren\
LS resrea.csa-i bs ce .axm d'euaa n'as; e'jtorsss ojs sajs ferns (fe fas^mis onoioarannaus li'llty.-d!.
=tuse n- <;2B5.'3S/- - RC3425.aOC page i-S
Centre d'Application de Levallois
L'etude est realisee sans analyse des solutions d'essai. En effet, la substance d'essai etant une preparation constituee de plusieurs composants solubles dans 1'eau, la methode NF EN ISO 28692 est appliquee plutot que la methode C3 de 1'annexe a la Directive 92/69/CEE. Cette methode permet de realiser 1'etude sans analyse des solutions d'essai. en exprimant les resultats sur la base des concentrations nominales. Les concentrations inhibitrices et NOEC presentees dans Ie tableau ci-dessus ont ete
calculees en utilisant les concentrations nominales en XHHUIIHf
Les observations visuelles ont pennis de verifier 1'aspect des solutions en debut et en fin d'essai : les solutions d'essai ont ete claires, non colorees et homogenes au cours de 1'essai. Aucune precipitation n'a ete observee en fin d'essai. Les observations microscopiques ont montre que 1'aspect des algues en fin d'essai etait normal par comparaison aux observations realisees dans la solution temoin : algues unicellulaires en forme de croissant de lune de taille moyenne 5-10 um. Les variations de pH en cours d'essai dans la serie temoin a ete de 0,52 unites. Les criteres de validite de 1'etude ont ete respectes: Ie rapport de densite (R) mesure dans la solution temoin est superieure a 16 (R = 71) ; Le pH des solutions temoins n'a pas varie de plus de 1,5 unites pendant 1'essai. La presente etude a ete realisee selon les principes de Bonnes Pratiques de Laboratoire de POCDE.
!^npanySanTlizeUao. es'ffol conlatn TSCA CB
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C11 ^LU^lIC;! Centre d'Application de Levallois
L'etude est realisee sans analyse des solutions d'essai. En effet, la substance d'essai etam une preparation constituee de plusieurs composants solubles dans 1'eau, la methode NF EN ISO 28692 est appliquee plutot que la methode C3 de 1'annexe a la Directive 92/69/CEE. Cette methode permet de realiser 1'etude sans analyse des solutions d'essai, en exprimant les resultats sur la base des concentrations nominales. Les concentrations inhibitrices et NOEC presentees dans Ie tableau ci-dessus ont ete
calculees en utihsant les concentrations nominales en ------------BR
Les observations visuelles ont pennis de verifier 1'aspect des solutions en debut et en fin d'essai : les solutions d'essai ont ete claires, non colorees et homogenes au cours de 1'essai. Aucune precipitation n'a ete observee en fm d'essai. Les observations microscopiques ont montre que 1'aspect des algues en fin d'essai etait normal par comparaison aux observations realisees dans la solution temoin : algues unicellulaires en forme de croissant de lune de taille moyenne 5-10 jj,m. Les variations de pH en cours d'essai dans la serie temoin a ete de 0,52 unites. Les criteres de validite de 1'etude ont ete respectes: Ie rapport de densite (R.) mesure dans la solution temoin est superieure a 16 (R = 71) ; Le pH des solutions temoins n'a pas vai-ie de plus de 1,5 unites pendant 1'essai. La presente etude a etc realisee selon les principes de Bonnes Pratiques de Laboratoire de 1'OCDE.
^Sanits^tf'ti'? ^ f";- CWiia^rt ''^S '^
Ce oxymat es; n3re praoriae. lim oai sre re coae, re sxrmxvsie 3 oss iere sars aulglgsm acxssss ^B AjacneTi. -a reannxoar. as cs i-asco-i tfeaxie n's; aua"s~ sie sois iot-re ai a^amfis orcEtnaDhnue rvsxsS. 'Si'jdE r.' 42S5/98/A - RC342E5.DOC psgs 3/2S
CIT Alocnem 3. M. Centre d'Application de Levallois
TECHNICAL SUMMARY
The determination of the growth inhibition (chronic toxicity) of the freshwater algae Pseudokirchnehella subcapitata (previously known as Raphidocelis subcapitata and
Selenasmim capricormitiim) exposed to the test substance 1------------MM----IMl JfMKor a duration of 72 hours was performed following the method C3 described in
Directive 92/69/EEC of the European Commission and in the guideline 201 of the
OECD.
Algae were exposed to a range of concentrations of<
^dissolved in dilution
water. The toxic effect measured during the assay was the inhibition of cellular
multiplication over a time period of 72 hours.
The study was performed using 100 ml glass erienmeyer flasks stoppered with cotton wool wrapped in sterilized gauze / 120 ml glass bottles stoppered with PTFE bungs and sealed with aluminium caps, containing 50 ml of test solution inoculated with an algal suspension so that the initial cell concentration was equal to IxlO4 cells/ml. Tests flasks were incubated at 22,2 0,5 C continuously shaken and constantly illuminated. The algal concentration was measured daily. Physico-chemical measurements were carried out at the beginning and the end of the test.
The concentration of test substance causing a 50 % reduction in biomass (EbC^o) or in growth rate (EpC^o) was determined. The No Observed Effect Concentration (NOEC), corresponding to the highest tested concentration where no significant effect was observed in comparison to the control, was determined using a statistical analytical method (Dunnett test). The results were as follows :
Effect nominal concentrations and NOEC (mg/1)
Value
EbCso-72h
Biomass 9.6
EbCio-72h
2,4
NOECb
1.9
Sr^so-7211
Growth rate
23
E,.Cio-72h
4,6
NOECr
9,4
C1: 95 % confident interval NT) : not determined
95 % CI
3-22 0,18-6
-
i4-45
1,9-8
-
'R^npanyBan^ize'd.TDoesnco'onttain TSCA ^
Ca cteumart es rcne proonss. I! re osit SETSre case. t corwnwT^ a !te tere ars autET^Srri SCTI-SSS c'3i ^.tccna'Ti.
La rasTOjgnn oi ce rarcor. ds-os vea ssoress sue sajs fcnre as iai-smBa arCTogramaLE Et3araiSiuas r.' 42S5/93fA. - ?>C3<2e5.30C paae 4,'29
Centre d'Application de Levallois
The study was carried out with no analytical determination of test concentrations according to the method NF EN 28692 which do not accessitate toanalyse the solutions. This method has been choosen since the test substance is a mixture of soluble chemicals. The effect concentrations and NOEC shown in the previous table have been calculated
using the nominal concentrations oftf------^Hh
The appearance of the test solutions was visually checked at the beginning and at the end of the test. Solutions were found to be clear and colourless over the period of the test. No precipitation was observed at the end of the test.
Microscopic observation confirmed that the algae appeared normal at the end of the test in comparison to the control : the normal form of the unicellular algae is a crescent shaped cell with an average length of 5-10 [im.
During the test, the control pH varied by 0,52 units.
The validity criteria of the study were respected : the increase in cell density (R), measured in the control solution between the end and the beginning of the the test, was greater than a factor of 16 (R = 71) ; the control pH not varied more than 1,5 units during
the test.
|3te.
The study was performed according to the principles of Good Laboratory Practice (GLP)
as described by OECD.
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Sigiiy^anh7^;^^^^^^?;, rscA ^
Ce asai-iar" ss .-OTS :>m=oss. li ns pe-f are rt caae. n; sorrE-.Lj-ous s oes iia?s sns afflraaari saresss c;li Ate=hs>T:. La ranriicon tie ce faaoor; d'suds nest sjsixses ws. sa-s tame ds fe-scra orooaraahnLE irisHa!. ESuse r,' 42e5,'98/A - P,C34255.DOC page 5;2S
tir Alocnem a. M. Centre d'Appiication de Levallois
RAPPORT D'ETUDE INHIBITION DE LA CROISSANCE DES ALGUES D'EAU DOUCE
N D'ETUDE :J
SOMMArRR
1. ASSURANCE QUALITE
2. SIGNATURES
3. IDENTIFICATIONS
9
3.1. Substance d'essai
9
3.2. Installation d'essais
9
3.3. Demandeur de I'etude
10
3.4. Calendrier
10
3.5. Archivage
10
4. OBJECTIF DE L'ETUDE
10
5. METHODE D'ESSAI
10
5.1. Introduction
10
5.2. Materiel et produits
11
5.3. Mode operatoire
12
6. MODE DE CALCUL
15
6.1. Calcu! des pourcentages d'inhibition
15
6.2. Calcul des rapports de densite (R)
16
6.3. Calcul des facteurs de croissance (k)
16
6.4. Calcul des concentrations inhibitrices
17
6.5. Determination des NOEC
17
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Ul ILt
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C<s:
18
7.1. Observations et mesures des parametres physico-chimiques
18
7.2. Concentrations algales, biomasse, et taux de croissance
18
7.3. Pourcentages d'inhibition
19
7.4. Concentations en substance d'essai
19
7.5. Concentrations inhibitrices et NOEC
20
7.6. Criteres de Qualite de I'etude
20
8. CONCLUSIONS
21
9. ANNEXES
22
9.1. Annexe 1 Composition de I'eau de dilution
22
9.2. Annexe 2 Pourcentages d'inhibition et courbes de croissance
24
9.3. Annexe 3 Concentrations inhibitrices calculees par la methode des Probits
26
9.4. Annexe 4 Bulletin d'analyse de la substance
28
9.5. Annexe 5 Bulletins d'analyses statistiques
29
^SWpaiiySahinze'd. Does hot conai
Ce ooKjms-E ss rare :yopri=. II ne OKA era i-i cooe. r-. ca-nmunaus das tE-s sans auffi^sasKr.sxsrssssdSfAtochsrr,. La rsoraxcasnos ce ~'ar\t 1'. rfsuae ness s'jsXTs^fSJS 33^ feymsdsBc-srnte U kj^ujidLJiU^us nt^ra!. studs r* <285.'95f'.1-. - RC34255.DOC page S/29
tir Atocnem 3. M. Centre d'Application de Levallois
1. ASSURANCE QIiAIJTK
La presente etude a ete realisee selon les principes de Bonnes Pratiques de Laboratoire de 1'OCDE.
Le Service Analyse-Environnement du Centre d'Application de Levallois dispose d'une reconnaissance de conformite aux BPL emise par le Groupement Intenninisteriel des Produits Chimiques (GIPC) en date du 8 mars 1993 et reconduite a la suite d'une inspection realisee par le Comite Francais d'Accreditation, les 9 et 10 Novembre 1998, conformement au decret n90-206 du 7 mars 1990, pour les domaines de competences suivants ;
- Etudes ecotoxicologiques sur les organismes aquatiques et terrestres.
- Etudes portant sur le comportement dans 1'eau, dans le sol et dans Pair ; bioaccumulation.
L'Auditeur Qualite du Centre d'Application de Levallois precede a des inspections periodiques et a des verifications en vue :
- d'etablir la concordance de 1'etude avec les Principes de Bonnes Pratiques de Laboratoire de 1'OCDE,
- de s'assurer que les methodes, les modes operatoires et les observations sont correctement decrits dans le rapport d'etude et que les resultats indiques refletent avec exactitude les donnees ecrites de Fetude.
Les dates correspondant a 1'audit de cette etude sont donnees ci-dessous :
16/10/98 - 09/03/98
L'Auditeur Qualite ou son suppleant:
Date ^.,
Signature
^owpa?iY'Sah^ea.'Wog Boi elmialh'YS^X eBS
Ce aoajmeni ea rore proprias.!' ns ne-E are r; coae, re cs-niunais a (KS tes srs auto'ssib-i esxssES ifE!? AosneTi. La raoma'jsxr. & ce raoccrt d'SLos n'ea amanses ae sous forms cte fas-a-nte srcteCTarihqie imMrai.
'
Stuae n- 42e5/3S;A - ?,;3';2S5.30C page 7;25
Elf Atochem S. A. Centre d'Application de Levallois
2. SIGNATTiRRS
Nous, soussignes, ceitifions que les informations contenues dans ce rapport concement uniquement la substance d'essai faisant 1'objet de cette etude, et refletent avec exactitude les resultats obtenus sous notre responsabilite dans Ie Service .Analyse Environnement du Centre d'Application de Levallois.
Le Chef du Service Analyse Environnement: M. BOURALY
Date
Signature
^ A/^
Le Directeur de 1'etude : H. THIEBAUD
Date
/
I i /<A^
ySffliTnze-d.DoesnbIconfahTSCAcw
Sa j.-o.iman: s; nars OTonste. II re ssu; c -E case. n asTenjrxtS a bas fiars ssrs a'-tonssan ecTesss c'3; Atscne'T-,
-2 'soroausa)-, oe ss tsaxrt a'siee " es suiaEK s-js SSLS tt-m as ias-scna srins.-Ep-iq'js evsxa.
tuae n 42S5/9S/A - RC342B5-DOC Dags S;'23
Elf Atochem a. A. Centre d'Application de Levallois
3. mRNTTFICATIONS
3.1. Substance d'essai
N3 CAS :
_____
9 f f y N d'enregistrement:
Caracteristiques principales : - apparence : liquide brun
- purete : - solubilite : completement soluble a 20C Precaution d'emploi et de conservation : voir FDS. Une copie du bulletin d'analyse de la substance est presentee en annexe 4. 3.2. Installation d'essais
ELF ATOCHEM CENTRE D'APPLICATION DE LEVALLOIS (CAL) SERVICE ANALYSE ENVIRONNEMENT
95 rue Danton 92300 LEVALLOIS-PERRET
Directeur de 1'etude :
H. THIEBAUD
Personnel implique dans 1'etude :
H. THIEBAUD Technicien(s) charge(s) de la realisation de 1'etude : C. KAE Redacteur du rapport d'etude : C. KAE
RismpaHSyanllized. Does ftot contain TSCA CBI
a xcumsrE ea nxs a'vsvs. t ns oeut SK rs cco. ni sammrEEe a resfes ssns auta^sBr' expRS i'3? Hsorsn. La resroxcfcn se cs rapoon effeoe ri es awses aus soys tarns as r3>scras srsxsaraahoue inEars;.
Etude n' 4285'96/fc - RC342S5.DOC BSOS 9/2
Cll r^t-u^i icil i w. <-*.
Centre d'Application de Levallois
3.3. Demandeur de 1'etude
M. DEVAUX(DFO) Moniteur de 1'etude : Mme BUREAU (DSEP)
3.4. Catendrier - Approbation du plan d'etude par Ie Moniteur de 1'etude : 20/10/98 - Debut de 1'etude : 18/10/98 - Fin de 1'etude: 06/11/98 - R-apport d'etude : 22/04/99
3.5. Archivage Les substances etudiees sont conservees dans Ie Service Analyse Environnement pendant une duree de 5 ans au maximum. L'ensemble des documents de 1'etude est conserve au moms 10 ans.
4, OBJECTTF DE L'F/niDF.
L'objectif de cette etude est de determiner la toxicite chronique (inhibition de la
croissance) du ^BBBUBMB vis-a-vis dss algues d'eau douce Pseudakirchnsnella
subcapitata en suivant Ie mode operatoire decrit dans la norme NT EN 28692.
^. fvTFTHODE D'ESSAI
5.1. Introduction
5.1.1. Principe Les algues vertes unicellulaires sont exposees a la substance d'essai ajoutee a 1'eau de dilution, dans une serie de concentrations donnee, pendant une periode de 72 heures. Les solutions ne sont pas renouvelees pendant 1'essai. Dans des conditions d'essai idenriques et pour une gamme de concentrations adequate, des concentrations differentes en substance d'essai out des effets differents sur la croissance dss algues, c'est a dire sur la multiplication csliulaire. En conseouencs. sn fir.
Se acjrrerr. ss rare prosea. Bns DSJ: are n ess.. rt ssrmxvsjs a ass dire ars auo-^iar, exsresss ;3f Alosrem.
L rea^ai-c&n 3e ce rasscn rf&de n'es auetsss CSJE S3LE tams ife ias-srfe proecgraonai^ iniaRi. iuae r," 425.'3S.'A. - RC342B5.DOC saae iO;'2S
^^.^^^
CIT Mtocnem o. M. Centre d'Application de Levallois
d'essai, a chaque concentration correspond un pourcentage d'inhibition de croissance des
algues. La concentration en substance a etudier qui provoque une reduction de 50o. soit de la croissance (CE^ob), soit du taux de croissance (CE^or) est, si possible, detenninee par calcul. La NOEC (No Observed Effect Concentration) ou CSEO (Concentration Sans Effet Observe ), qui correspond a la plus forte concentration testee qui ne creee pas d'effet significatif par rapport au temoin, est par ailleurs detenninee par une methode d'analyse statistique.
L'etude est conduite en deux etapes :
- un essai preliminaire qui sert a determiner
definitif. Cet essai consiste a exposer les generalement comprises entre 0,1 et 100 mg/1.
la gamine des algues a une
concentrations pour Fessai gamme de concentrations
- un essai definitif, dont seui Ie resultat est retenu.
Si V essai preliminaire montre une absence de toxicite sur la gamme de concentrations testees, un essai definitif peut etre realise a des concentrations superieures a 100 mg/1 si la solubilite de la substance Ie permet. Ou alors, il peut etre realise un essai limite a 100 mg/1 ou a la limite de solubilite, si celle-ci est inferieure a 100 mg/1.
5.1.2. References
- Noi-me NF EN 28692 (Mai 1993). - Plan Qualite n7 : Toxicite chronique vis-a-vis des algues. - Plan d'etude du : 14/10/98
5.1.3. Deviations
K^';-v
^
5.2. Materiel et produits
5.2. i. Materiel L'etude a etc realisee dans une armoire de phytoculture qui permet d'mcuber les fl aeons d'essai dans des conditions precises : la temperature est programmee a 22C ; les flacons, disposes sur des plateaux a rotation altemee de 20 rpm, sont unifonnement eclaires en passant devant 8 tubes fluorescents. La temperature relevee en continu dans un flacon d'essai a ete comprise entre 21 et 23 C.
Ce axajrnsrt ss. rore Dtoriss. I! re ce.t Srs ni soac. re canrnunb-js a Qss iies sns auttr'sttr'. sorsse rfElf Amcns-,.
^ , ,, ^ . -- l n T S " c " -s rsroa.cbsn oa cs raspai d'a-os n esi a'jCTSss 3.S soji fa-Tre ce B^SCTIK pt3O0D3s3ssnris3TLJES rirecssyysci. t\W9 r, 42a5/95/A - RC342B5.00C csne .1/29
f^oi
t=ir Atocnem 3. M. Centre d'Application de Levallois
Les parametres physico-chimiques ont ete mesures au moyen d'un pHmetre Mettler Toledo 345 pour les mesures de pH et d'un oxymetre WTW 0X1 538 pour les mesures de 1'oxygene dissous.
La determination de la concentration algale a ete realisee par comptage au microscope optique Zeiss RA34 a 1'aide d'un hematimetre (cellule de Malassez) lors de 1'essai definitif, et par cytofluorimetrie a 1'aide du lecteur de microplaques (Cytofluor 2350) dans Ie cadre de 1'essai preliminaire.
Les recipients pour essai sont des fioles erienmeyer en verre de 100 ml. bouchees a 1'aide de coton carde emballe dans de la gaze.
5.2.2. Produits et reactjfs - Eau : pour la preparation des solutions meres du milieu d'essai, il est fait usage d'eau ultrapure (ultrafiltration, charbon actif, echange d'ions, filtre 0,22 u,m) ; de meme, pour la realisation du milieu d'essai (eau de dilution) les solutions meres sont diluees dans de 1'eau ultrapure.
- Reactif biologique : les organismes pour essai sont les algues d'eau douce, vertes et unicellulaires, Pseitdokirchnefiella siihcapitata souche CCAP 278/4 (precedemment nominee Raphidocelis subcapitata et Selenastrum capricornntvm) ; la souche utilisee a ete obtenue aupres du Culture Center of Algae and Protozoa.
- Reactifs chimiques : les reactifs utilises pour la preparation de 1'eau de dilution (voir annexe 1) sont de qualite "pour analyse".
5.3. Mode operatoire
5.3.1. Culture et preculture des algues
Deux flacons contenant environ 100 ml chacun d'une culture mere axenique sont maintenus en permanence a 23=1 ^-C sous eclairement photoperiodique de 16 heures d'illumination pour 8 heures d'obscurite. et sous aeration continue par de 1'air filtre a 0.22 urn. Ces cultures meres sont renouvelees chaque semame par deux nouvelles culmres repiquees a partir des cultures precedentes.
La qualite des cultures meres est verifiee avant chaque utilisation par un examen microscopique pour verifier 1'absence de microorgaiusmes et de cellules deformees.
4 jours avant Ie demarrage d'un essai, deux pre-cultures sont realisees par dilution de chaque culture mere. De facon sterile, 5 ml de culture mere sont dilues dans 500 ml d'eau de dilution sterile. L'incubation est realisee selon Ie meme protocole que celui decrit ci-
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Cll rtlUl-lieill .3. r\. Centre d'Application de Levallois
dessus pour les cultures meres. Une seule des 2 pre-cultures sen a ensemencer les fioles d'essai, la seconde est preparee au cas ou la premiere venait a etre endommagee.
Le jour de 1'essai, environ 50 ml de la pre-culture sont preleves sterilement et transferes dans un recipient. La concentration cellulaire de cette aliquote est determinee afin de calculer le volume de pre-culture algale a ajouter a chaque recipient d'essai pour obtenir une concentration algale de 104 cellules/ml a TO. La concentration algale de la pre-culture est de 7,83 106 cellules/ml pour 1'essai preliminaire et de 6,69 106 cellules/ml pour 1'essai defmitif.
5.3.2. Preparation des solutions
Les solutions de f--------Rdans 1'eau de dilution sont preparees lejour de 1'essai.
5.3.3. Essai preliminaire
K^
_)
flUBHHk^ Des volumes adequats d'une solution mere de
100 ^g/l dans 1'eau de
dilution sont verses dans des fioies jaugees de 100 ml et completes par de 1'eau de
dilution pour obtenir la gamme de concentrations nominales allant de 0,1 a 100 mg/1.
Les solutions d'essai preparees sont ensemencees afm d'obtemr une concentration initiale de 104 cellules/ml.
Les fioles sont alors bouchees avec du coton carde emballe dans de la gaze et placees dans rarmoire de phytoculture.
Un recipient temoin (T) contenant 1'eau de dilution et 1'inoculum algal ainsi qu'un recipient "blanc" (Bl) contenant seulement 1'eau de dilution sont prepares et incubes dans
les memes conditions.
Apres 24 h, 48h et 72h d'mcubarion, un volume de 200 ul est preleve sous agitation dans chaque recipient d'essai et icrroduit dans un puits d'une nucroplaque en quartz qui est conservee a 1'obscurite avant de mesurer la fluorescence. Cette mesure est realisee a 1'aide du cytofluorimetre et, par comparaison a une gamme d'etalonnage, la concentration algale
est determinee en fonction de la fluorescence mesures. La concentration mesuree est utiiisee pour le calcul des pourcentages d'inhibidon .
Le pH et I'O; dissous sont mesures a la plus forte concentration et dans le temoin, en debut d'essai dans la fraction non utiiisee de la solution d'essai ensemencee, et en fin d'essai dans le flacon d'essai ensemence.
Les resultats obtenus servent a defmir la gamme de concentrations de 1'essai definitif.
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s OS tes &'% aua-sson "oresss cr3f Aio=heT,.
Is rep'oa'-aan os ce isxori d'e'-oe n'es; auio'^s; oua sous iarrre de i3>SE-ite ?'t3:03ra;niartCTa.
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-a'-rt^ri^P_S,i--fi'S-
ElfAtochem S. A. Centre d'Application de Levallois
5.3.4. Essai defmitif
de^UMBBBI m^ Des volumes adequats d'une solution mere
a 100
dans I'eau de
dilution sont verses dans des fioles jaugees de 200 ml et completes par de I'eau de
dilution pour obtenir la gamme de concentrations nominales allant de 0,9 a 100 mg/1.
Les concentrations sont choisies de maniere a former une progression geometrique avec un rapport de 2,2..
La preparation des solutions d'essai est realisee comme decrit pour 1'essai preliminaire. 3 repliques sont preparees par concentration testee et pour Ie temoin.
Les solutions d'essai preparees sont ensemencees afin d'obtenir une concentration initiale de 104 cellules/ml.
Les flacons sont alors bouches avec du coton carde emballe dans de la gaze et places dans 1'armoire de phytoculture.
3 recipients temoins (T) contenant I'eau de dilution et 1'Lnoculum algal ainsi que 3 recipients "blanc" (Bl) contenant seulement I'eau de dilution sont prepares et incubes dans
les memes conditions.
Apres 24 h, 48h et 72h d'incubation, un volume suffisant et inferieur a 1 ml, est preleve sous agitation dans chaque recipient d'essai et introduit dans un tube a hemolyse. Apres chaque prelevement, les flacons d'essai sont repositionnes dans 1'amioire de phytoculture. Les tubes a hemolyse sont conserves a 1'obscurite. Au moment-du comptage, les tubes sont agites manuellement, et une fraction de la solution est prelevee afm de determiner la concentration algale dans chaque recipient d'essai. La concentration mesuree est utilisee pour Ie calcul des pourcentages d'inhibition et la determination des courbes de
croissances.
Le pH et I'O^ dissous sont mesures a toutes les concentrations en debut d'essai et en fin
d'essai.
5.3.5. Controle de sensibilit8 du reactifbiologioue
La sensibilite du reactif biologique est controlee environ tous les 2 mois en realisant un essai de toxicite avec le dichromate de potassium. La CE^or -. "^h et la CE^ob - 72h du dichromats de potassium sont determinees. A titre indicarif, les resultats du dernier essai,
realise le 09/10/98, ont abouti a une CE^r - ^h de 0,98 mg/1 et une CE^ob - "^h de 0,33
mg/1.
3e3Xj~in:2sn3Ro'33ri=JlreDS^5^n;K)?e.rtcocTE7ijno^scteiEfSsa^auts^3i^^
i, ^'-
^;. La rearoouac'i cs s [srcort (TSJCK nea a'J".o'ss ajs so-a fonnE ds iao-smte wsxEasvajstisis.
Eluos n'4255/98/A. - RC542E5.30C oags i.4'2S
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Centre d'Application de Levallois
6. MODE DE r-urni
6.1. Calcul des pourcentages d'inhibition
Les pourcentages d'inhibition ont etc calcules en suivant deux modes, 1'un utilisant les valeurs de la biomasse integrale, Ie second les valeurs des taux de croissance.
Biomasse integrale La surface comprise entre la courbe de croissance et la ligne horizontale, ou aire sous la courbe, est calculee a 1'aide de la fonnule suivante :
A = --N,---N--,,--xt, + --N--,+--N^.---2--N--,,- x(/ t;-t,)+^ ...---N1,--+N---^2--N--n--^/ x(t,,-tjv
avec : A, 1'aire sous la courbe ; No, la concentration algale (cell/ml) au debut de 1'essai;
NI, la concentration algale (cell/ml) au temps t[ (t[), Nn, la concentration algale (cell/ml) en fm d'essai (tn);
t[. Ie temps (heures) ecoule entre Ie debut de 1'essai et Ie premier jour de mesurage ; t;i. Ie temps (heures) ecoule entre Ie debut de 1'essai et Ie dernier jour d'essai.
Les valeurs de A sont calculees pour chaque replique des differentes solutions d'e&sai et du temoin. Le pourcentage moyen d'inhibition de la croissance de la biomasse I^j est ensuite calcule pour chaque concentration d'essai a 1'aide de la fonnule suivante :
I,=^--------^KlOO
"c
avec : A,-. 1'aire moverine sous la courbe de croissance du temoin ;
A,, 1'aire moyenne sous la courbe de croissance a la concentration d'essai i.
Ces valeurs Ac e*i A, sont calculees en moyennant les valeurs des aires sous la courbe des repliques pour chaque concentration d'essai.
Les concentrations efficacss (inhibimces) pour x % de la population sont notees CE^
lorsque les caiculs sont realises a partir des pourcentages moyens d'mhibttion de la croissance de la biomasse (1^;).
Cs aocuTCn; ea -iare croores0.11 ns ce-S. ar re coaa. ni sxrcmrxTJe s as fes sars aLEorescn eayesss c'5" Atccte-,.
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cir rtiocnem a. M. Centre d'Application de Levallois
Taux de croissance
Les taux de croissance specifique (^) pour les cultures en exponentielle sont calcules pour chaque replique aux differentes
avec 1'equarion :
phase de croissance concentrations d'essai
ou to correspond au debut de 1'essai.
InN-lnNo
p. = ----"--------"-
tn-t,
Le pourcentage moyen d'inhibition du taux de croissance specifique (L,) est eosuite
calcule pour chaque concentration d'essai a 1'aide de la formule suivante :
,,i=^=^-x100
^
avec :
/^, le taux de croissance specifique moyen du temom ; ^;, le taux de croissance specifique moyen a la concentration d'essai i.
Les concentrations efficaces (inhibitrices) pour x % de la population sont notees CE^ lorsque les calculs sont realises a partir des pourcentages d'inhibition du taux de
croissance specifique (I,y).
6.2. Calcul des rapports de densite (R)
Le rapport de densite (R) calcule pour chaque concentration et pour le temom, est egal au rapport des concentrations cellulaires moyermes en fin d'essai (Nn) et au debut de 1'essai (No):
R=S
N-,
6.3. Calcul des facteurs de croissance (k)
Le facteur de croissance (k) est egal a :
ou T est le temps en jour.
LnN^-LnNp K-------T------
Le facteur de croissance est 1'equivalent d'un taux de croissance moyen par jour d'essai.
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v^^'^''-' as CecteuTieTes-.pareEfDprisc.li re osj: are re ssoe. n cat-nuna.e a ass ba'sarsautarEsiiriSsrssetfEBAiaaTan-... ---3';<..> i; ?'''-'"
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ElfAtochem S. A. Centre d'Application de Levallois
6.4. Calcul des concentrations inhibitrices
La relation existante entre 1'expression de la toxicite (ici 1'inhibition de croissance algale) et la concentration de la substance ne suit pas un modele lineaire. Par consequent, la methode de linearisation qui a ete employee pour determiner les concentrations inhibitrices (concentrations efficaces) est la relation Probit/log.
6.5. Determination des NOEC
La NOEC (No Observed Effect Concentration), ou concentration sans effet observable (CSEO), a ete determinee par analyse statistique en appliquant la methode de Dunnett a 1'aide de la version 1.5 du programme etabli par 1'US EPA. Deux valeurs de NOEC ont
ete determinees :
- La NOECb, calculee par comparaison statistique des valeurs des aires sous la courbe de croissance (A) des repliques de chaque concentration avec Ie temoin ;
- La NOEC,., calculee par comparaison statistique des valeurs des taux de croissance (u) des repliques de chaque concentration avec Ie temoin.
CecKxnistssnarec^sri^JireiHLfSrericise.n.canrTiiriqLeacEstessaTsaums^^
L^rsot^j=3sncece.-asGr;G'CTj3sne;aLta'BSi;^so-sfam'e(Ki3^5CTea-cio^ Elude r,'-285/9S;A - r'CMZSs.DOC page i7/25
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t=ir Alocnem a. M. Centre d'Application de Levallois
s)
7. RF:.SI;LTATS
7.1. Observations et mesures des parametres phvsico-chimiques
Les observations visuelles ont permis de verifier 1'aspect des solutions en debut et en fin d'essai : les solutions d'essai ont ete claires, non colorees et homogenes au cours de I'essai. Aucune precipitation n'a ete observee en fin d'essai.
Les observations microscopiques ont montre que 1'aspect des algues en fin d'essai etait normal par comparaison aux observations realisees dans la solution temoin : algues unicellulaires en forme de croissant de lune de taille moyenne 5-10 am.
Le pH et la teneur en oxygene dissous ont ete mesures dans les solutions d'essai en debut et en fin d'essai :
Echantillon
Reference T g f
e
d
c
b
a
Concentration nominale (ms/1)
0
0.9 1.9
4.3 9,4 20,7 45,5 100
P H
TO
8.05 7.82 7,86 7,88 7,82 7.75 7.80 7.88
T72h
7.53 7.35 7,37 7.42 7.30 7.35 7,35 7.39
0; disso us (mg/t)
TO
T72h
8.0
8.6
7.8
8.5
8.3
8.5
8,1
8.2
8,0
8.2
8.2
8.2
8.0
8.2
8.0
8.0
7.2. Concentrations aigales. biomasse. et taux de croissance
L'aimexe 2 presente les concentrations ceilulaires de chaque replique et leur moyenne mesurees au moment de I'essai definitif a 0, 24, 48 et 72 heures. Les valeurs moyennes calculees des aires sous la courbe (A) et des iaux de croissance (u) sont presentees dans cette annexe et resumees dans le tableau ci-dessous :
Ceoaaiment^norepfopr^JIrisp^g^rtcooe.nicomniri^aassfe^s.^auarsat^.e^^
V0' La reDrasxsan de cs raaxct fsjss n'es: a-ox^s aus sas fsms (K te>^ims s-cosashiaus atsxS
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CToflQI ^,,f,'f6&-
Elf Atocnem s>. A. Centre d'Application de Levallois
Echantillon
Reference T
g f e d
c
b
, n
Concentration nominate (ing/I)
0
0.9 1.9 4.3 9.4 20.7 45.5 100
Concentra tion alsale moyenne(cellules/ml)
A
TO .OOE+04 .OOE+04 .OOE+04 .OOE+04 .OOE+04 l.OOE+04 l.OOE+04 l.OOE+04
T24h
T48h
1.40E+04 7.57E+04
l.OOE+04 7.67E+04
1.20E+04 7.13E+04
7.00E+03 5.23E+04
1.13E+04 5.13E+04
9.00E+03 4.30E+04
1.33E+04 2.93 E+04
7.00E+03 t 2.37E+04
T72h 7.10E+05 7.57E+05 7.35E+05 3.46E+05 3.20E+05 6.60E+04 2.67E+04 2.37E+04
1.01E-07 1.06E+07 1.02E-07 4.98E+06 4.74E+06 1.44E-06 7.44E+05 4.20E+05
1.1
0.0592 0.06(11 0.0597 0.0492 0.0481 0.0262 11.0136 0.0120
I/annexe 2 presente par ailleurs les moyennes des rapports de densite (R) et des facteurs de croissance (k) pour chaque concentration d'essai et pour Ie temoin. La valeur du rapport moyen de densite dans Ie temoin est de 71 ce qui est superieur a la valeur minimale de 16 (cf. criteres de validite).
Les courbes de croissance moyenne a chaque concentration et pour Ie temoin figurent dans 1'annexe 2. Dans la serie temoin, la cinetique presente bien une phase initiale de latence au debut de 1'essai suivie d'une phase exponentielle de croissance.
7.3. Pourcentages d'inhibition
Les pourcentages moyens d'inhibition calcules a partir de la biomasse integrale (IAi) et des taux de croissance (lui) sont presentes dans Ie tableau ci-dessous :
Echantillon
Reference
T
Concentration nominate (me/I)
0
0
!
f
e
d
C
b
a
0.9
1
!."
4.3
9.4
20.7
45,5
10Q
IAi
(%)
0,00 -4.85 -1.4" 50,60 52,94 85,70 92.61 95,83
4"
(%)
0.00 -1.49 -0.81 16.86 18,72 55.73 76,99 79.79
fe)
7.4. Concentations en substance d'essai
L'etude est realisee sans analyse des solutions d'essai. La substance d'essai etant une
preparation constitueede plusieurs composants solubles dans 1'eau, la methode NF EN ISO 28692 est appliquee plutot que la methode C3 de 1'annexe a la Directive 92/69/CEE.
Cette methode permet de realiser 1'etude sans analyse des solutions d'essai, en exprimant les resultats sur la base des concentrations nominales.
Les concentrations nominales son? utilisees pour les calculs des concentrations inhibitrices.
CsossirnareKSnaresrcofi^JIrepeusarertase.niKiTCT^j-EsieaQsosraa-sa'jc^^
.srso'arjaiOTaecsraannc'&reriesaitosesaussasioeTrsdeiao^niKDhacKira:^
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noeSnO^ lain TSCA ^
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t=ir Atocnem s. M. Centre d'Application de Levallois
7.5. Concentrations inhibitrices et NOEC
Les calculs des concentrations inhibitrices (concentrations efficaces) sont presentes en
annexe 3. Le bulletin d'analyse statistique pour la determination des NOEC est presente en annexe 5. Les valeurs de CE^o, CE(O, et NOEC, sont mentionnees dans !e tableau ci-
dessous :
Concentration nominale inhibitrice et NOEC (mg/1)
valeur
1C a 95 %
Biomasse integrale
CE5ob-72h
9.6
3-22
CE,ob-72h
2.4
0,18-6
NOECb
-1.9
-
Taux de croissance
CE50r-72h
23
14-45
CEior-72h
4,6
NOECr
9.4
1C : intervalle de confiance NT) : non determine
1,9-8
-
7.6. Criteres de Qualite de I'etude
7.6.1. Rapport de densite
Le rapport de densite R de la solutions ternoin est superieur a 16 en 72h (R = 71).
7.6.2. Variation de pH Le pH des solutions temoms n'a pas varie de plus de 1,5 unites pendant 1'essai.
Ce (Ecunan es; noffs wyes. II re ssj: s? ri soos. re saTtTKraaus 31^ ts^s ars ojar^sfan' _2 'crE-s3on 3 ce sxio; G'SJCR ns aacrsss 3-e sos fome as fs>srss ct Htade r,' 425.'s8.'A - RC342E5.DOC sage 20.-2S '^2-
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fcir Atocnem a. M. Centre d'Application de Levallois
8. CONCLUSIONS
L'etude de la toxicite chromque (inhibition de la croissance) d^lf^J----tt^is-a-vis
des algues d'eau douce PseLidokirchneriella subcapitata a permis de determiner les concentrations inhibitrices et les concentrations sans effets observables presentees dans Ie tableau suivant:
Concentration nominale inhibitrice et NOEC (mg/1)
valeur
1C a 95 %
Biomasse integrale
CE5ob-72h
9,6
3-22
CEiob-72h
2.4
NOEC(,
1,9
0,18-6
-
Taux de croissance
CEsor-72h
23
14-45
CEior-72h
4,6
NOECr
9.4
1C : intervalle de coiifiance NT) : 11011 determine
1,9-8
-
Les criteres de validite de 1'etude ont ete respectes.
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W^i^^.6, 9'^
Ce sccu-erE ea r>3oe aresys". Bre ce^ 13 rs soae. -t ca-munaLie e des OS's ars ai'jjii-i^n-. asxssv rfElf Atccrtsrr;. L2 raaror-cicn cte cs .sxon d'sre n es aLsarsss OB sajs ibrma cfe faa-anlis DtasaraohOLE niCTra. ^fjce r,' 42S5/SS/A. - R2342S5.00C page 21.'2C
Elf Atocnem a. A. Centre d'Application de Levallois
9. ANNEXES
9.1. Annexe 1 : Composition de I'eau de dilution
Quatre solutions meres sont preparees par dilution dans I'eau ultra-pure des elements
decrits dans les tableaux suivants (cf paragraphe 4.3 de la norme NF EN 28692) :
Substance
NH,CI MgCl2.6H^O CaClz.ZH^O MgS04.7H;0 KH^PO^
FeCl^^H^O (Na;EDTA.2H;0)
HyBOf MnCl;4H;0
ZnCI; CoCl^H^O CuCI^H^O Na;Mo04.2H;0
NaHC03
Concentration dans la solution mere
Concentration finale
Solution mere I : macro-nutriments
1.5 g/l
15 mg/1
1.2 g/l
12 mg/1
1.8 g/l 1.5 g/1
18 mg/1 15 mg/1
0.16 g/l
Solution mere 2 : Fe - EDTA
SOmg/l 100 mg/1
Solution mere 3 : oligo-elements
185 mg/1 415 ing/! 3 mg/1 1.5 mg/1 0.01 nig/] 7 ms/1
1,6 mg/1
0.08 mg/1 0,1 mg/1
0.185 mg/1 0.415 mg/1 3 x 10-3 mg/1 1,5 x 10-3 mg/1 10-5 me/I 7 x 10-3 mg/i
Solution mere 4 : NaHCO}
50 g/l
50 mg/1
'l^panylSanrnasdS.o-e?n'6f(?6nfem f(?A ^i1
Ce ttejmsrs ea .'OGS preori's. l! ns psa ara ni csoe. .< cammLniaLE o cte fes sa-e auzrssnE', enrasss tfEF Wo=re?r.. La .-scnaLEaa'-, oe =a raaxr d'sxte ns; autorss cr-e sss ton-e tK jas-smis :n3cg.-ayiaus irtg^. ;uos n- 425.93,:A - =034285.000 page ZZTM
Elf Atochem s. A. Centre d'Application de Levallois
Les solutions meres sont preparees par dilution des substances (pesees avec une precision indiquee par Ie nombre de decimale dans Ie tableau ci-dessus) dans de 1'eau ultra-pure prealablement sterilisee a I'autoclave. Elles sont ensuite sterilisees par autoclavage
(solutions 1, 2 et 3) ou par 'filtration (solution 4) sur membrane (diametre de pores de 0,22 um) et stockees a 1'obscurite a 4C.
Pour preparer 0,5, I, 2 ou 5 litres d'eau de dilution a partir des solutions precedemment decrites, verser les volumes specifies dans Ie tableau ci-dessous dans environ 0,4, 0.8, 1.5 ou 4 litres d'eau ultra-pure. Ajuster a 0,5, 1, 2 ou 5 litres avec de 1'eau ultra-pure et homogeneiser. Cette operation est realisee en ambiance sterile autour d'un bee Bunsen et avec des pipettes sterilesjetables.
Eau de dilution (0,5, 1, 2 ou 5 litres) Volume a diluer (ml)
Solution n 1
5
10
20
50
Solution n 2
0,5
1
2
5
Solution n 3
0,5
1
2
5
Solution n 4
0,5
1
2
5
Eau ultra-pure (QSP)
0,5 litre 1 litre 2 litres 5 litres
Apres equilibrage avec 1'air, Ie pH de 1'eau de dilution est d'environ 8. Cette eau de dilution ne peut etre conservee que quelques jours a 232C et a 1'obscurite.
'^B^nySiiWz^a.'noeaTOlisftlaInT^A ^
Ce oxumat es roce proore's. Sne aesji ars r zoe, rn ccnCTtjnalE c IES Ssrs. ss"s auoraa^n aorease ;?3'Atef's--,. i-s re3?o3'-C!Kn as se rasoan tf&ris n'es s^rsss as. SOLE lonre as is^simK ohoaxEasmus Eteors. 5iuoe n' 4285/9S/A. - RC342S5.00C Daoe 23;-29
ElfAtochem 5. A. Centre d'Application de Levallois
9.2. Annexe 2 : Pourcenta2es d'inhibition et courbes de croissance
Essai de toxicite vis-a-vis des algues
;
Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et courbes de croissance
Echantillon
Date :| OS-nov-ii"
N d'etude
Initiales Technician
CKE
Echantillorl Reference
T T T T g 9 g 8 f f f f
e e
e e
d d d d
c
u
c c
b b b b
3 a a a
Replicat N
1 2 3
moy.
1
2
3
moy.
1 2
3
moy.
1 2
3
moy.
1
2 3
moy.
1
2
^
moy.
1
2 3
moy.
1
2
!
3
moy.
1
2
3
moy.
1
2 3
moy.
C oncentration algale (CelU mi)
TO
T24h
T48h
T72h
1,05+04 1,OE+04
1 ,OE+04 1,OOE+04 1 ,OE+04 1.0E+04 1,OE+04 1 .OOE+04 1 ,OE+04 1,OE+04
1,90E+04 1,70E+04 6.00E+03 1,40E+04 1.30E+04 1,1OE+04 6.00E+03 1,OOE+04
1,60E+04 9,OOE+03
8,30E+04 8,10E+04 6.30E+04 7.57E+04 7.70E+04 9.90E+04 5.40E+04 7.67E+04 7.50E+04 4,80E+04
6.65E+05 7.55E+05 7.10E+05 7.10E+05 7.15E+05 9.40E+05 6.15E+05 7,57E+05 9,60E+05 4,40E+05
1,OE+04 1 ,OOE+04
1,1OE+04 1,20E+04
9,1OE+04 7,13E+04
8,05E+05 7.35E+05
1 ,OE+04 1,OE+04 1,OE+04 1 ,OOE+04
7.00E+03 5.00E+03 9.00E+03 7,OOE+03
4.70E+04 8.20E+04 2,80E+04 5.23E+04
4.70E+05 4.60E+05 1.08E+05 3,46E+05
1,OE+04 9,OOE+03 5,1OE+04 3,35E+05
1,OE+04 1 ,OE+04 1,OOE+04
1 .OE+04 1 .OE+04
1,05-04
1,OOE+04 1 .OE+04
1.50E+04 1 ,OOE+04 1,13E+04 8,OOE+03 9.00E+03 1 .OOE+04 9,OOE+03 1,70E+04
5.50E+04 4.80E+04 5,13E+04 3,30E+04 4.1OE+04
5,50-04 4.30E+04 3,40E+04
4.90E+05 1.34E+05 3.20E+05 9.30E+04 4,50E+04 6,OOE-04 6,60E+04 2,1OE+04
1 ,OE+04 1 ,OE+04 1,OOE+04
1.0E+04 1,OE+04 1 .OE-04 1,OOE+04
1.20E+04 1,1OE+04 1.33E+04 9.00E+03 5.00E^03 7,005+03 7.00E+03
1.80E+04 3,60E+04 2,93E+04 2.00E+04 2.00E+04 3,1OE+04 2.37E+04
2.40E+04 3.50E+04 2.67E+04 2.20E+04 2.20E-04 2.70E+04 2,37E+04
SDIV/01
#DIV/01
#OIV/0!
#DIV/01
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/01
A
9.83E+06 1.08E+07 9,58E+06 1,01E+07 1,01E+07 1.33E+07 8.22E+06 1.06E+07 1.31E+07 6.05E+06 1.15E+07 1.02E+07 6.34E+06 7.01E+06 1.58E+06 4.98E+06 4,86E+06 6.96E+06 2.40E+06 4.74E+06 1.50E+06 1.14E+06 ',.3SE-06 1.44E+06 8,76E+05
4,08E+05 9.48E+05 7.44E+05 3.60E+05 2.54E+05 5,36E-05 4,20E+05
#N/A #N/A #N/A #DlV/0! #N/A #N/A #N/A #DIV/0!
M
0,0583 0,0601 0,0592 0.0592 0,0593 0,0631 0,0572 0,0601 0,0634 0,0526 0,0609 0,0597 0,0535 0,0532 0,0330 0,0492 0,0488 0,0541 0,0360 0,0481 0,0310 0,0209 0.3249 0.0262 0,0103
0,0122 0,0174 0,0136 0,0110 0.0110 0.0136 0,0120 #N/A #N/A #N/A #DIV/0! #N/A #N/A #N/A #DIV/0!
^W'8"' Cs axisnsrr, es ret" Dfcori~. II ne ssu &5 re cope. n csrrmjnc-E EBdsstesarsauto.-ssimsCTESsetfS'ABsnaT].
TtneSTlOtC^
'_2 rssrosraa-i as cs rsDoal rf&ds n s; auorsss sus SO-LsS rscrre (dfse fassa--sSeTnWK :a'aoasao^&c-^in.'ganidlUZBO- ---
tuoe r,' <2S'93/A. - RC342E5.DOC page 24,29'
ElfAtochem S. A. Centre d'Application de Levallois
Essai de toxicite vis-a-vis des algues
Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et courbes de croissance
Echantillon
Date : | 03-nov-98
N d'etude
Initiales Technicien :f CKE
Echantillon Reference
T
9 f
e
d
c
b
a
#N/A #N/A
Concentration algale moyenne (CelUmI)
0
24
48
72
1 .OOE+04 1 .OOE+04 1 .OOE+04 1,OOE+04 1 ,OOE+04 1 .OOE+04 1.OOE+04 1,OOE+04 #DIV/0! #DIV/0!
1.40E+04 1,OOE+04 1.20E+04 7.00E+03 1.13E+04 9.00E+03 1.33E+04 7.00E+03 #D!V/0! #DIV/0!
7.57E+04 7.67E+04 7.13E+04 5.23E+04 5.13E+04 4.30E+04 2.93E+04 2.37E+04 TOIV/0! #DIV/0!
7.10E+05 7.57E+05 7.35E+05 3.46E+05 3,20E+05 6,60E+04 2.67E+04 2.37E+04 #DlV/0! #DIV/0!
Rapport (R) densites 71 76 74 35 32
7
3
2 #DIV/0! #DIV/0!
Facteur k(J-1)
1,421 1,442 1,432 1.181 1,155 0,629 0.327 0.287 #DIV/0! #DIV/0!
Pourcentages moyens d'inhibition
Echantillon Biomasse
Taux de
Reference
Integra Ie
croissance
IAi (%)
iMi (%)
T
0,00
0,00
g
-4,85
-1,49
f
-1,47
-0,81
e
50,60
16,86
d
52,94
18,72
c
85,70
55,73
b
92,61
76,99
a
#N/A #N/A
95,83 #DIV/0! #DIV/0!
79,79 #D!V/0! #D!V/0!
Validite de I'essai (Condition : R temoin > 16)
OUl
Courbes de cra'ssance des algues
\ ^ 7,OOE+05
iu c nncArw
: 2 5.00S-C5 . ! 5"
^ 4.00*Q5
0
'5 3.00E+05
2,OOE*05
5 1,OOE<-C6
O.OOE+00 9
0
'^------~'
;
w
-
~
.'
^ ^
-------/ ^----4
X ^ ^ ' --~~^U^^M^^^--fl^-r"'.--.-.-------- - ---^
2 4
4i8
72
Temps (heures)
g .....+..... f ---.e --o---- d -..-X..-..C -.-&.-.b .....a...... a ---.UN/A ----0----#N/A |
,, - - ,, , xxrmivsjE a aas oare
SJtS03S3^W3^S^S-
ta reoroa'.rmri as ce rasSolucnaea'nsr<e2nSa5s/9.aSsuL/ri.D-raaRsCo3^s4a2^5i5oEDTOTeCne^fac-sCzT^iiEfiprtSCCTSeOWTCpiLaer^aEyirsS1.aflWz^. l5oe s .n.,o-_l enoTnfitaalnTSCA CD"
Elf Atocnem a. f\. Centre d'Application de Levallois
9.3. Annexe 3 : Concentrations inhibitrices calculees par la methods des Probits
TOXIC1TE CHRONIQUE VIS-A-VIS DES ALGUES Feuille de calcul des concentrations Inhibitrices par la methode des Probits
Substance etudiee :
Date :f
06/11/98
Numero d'etude :
Initiales Technicien :[
CKE
Methode par mesure de la biomasse integrale
Donnees utilisees pour Ie calcul
Cone. Inhibitrices (CExb)
Concentration
inhibition (IAi)
PROBIT
log cone.
X
nominale
(%)
corn gee
y
X
(%)
mg/1
(%)
CE, inf.
CExb
100 45,5 20.7 9.4 4.3 1,9
nb valeurs 6
95,8 92.6 85,7 52,9 50.6 -1,5
96 93 86 53 51 1 #N/A #N/A #N/A Somme Moyenne
6.750
2.000
5
6.480
1,658
10
6,080
1,316
15
5.080
0,973
20
5.030
0,633
25
2,670
0,279
30
#N/A
SNOMBRE!
35
#N/A
#NOMBRE!
40
#IM/A
#NOMBRE!
45
32.090
6.859
50
5,348
1.143
55
r2= 0.855
60
65
70
75
80
0,077
1.6
0.18
2,4
0,32
3,1
0,5
3.9
0,74
4.7
1
5,5
1,4
6,3
1,8
7.3
2,3
8,3
3
9,6
3.8
11
4,6
13
5.8
15
7,1
17
8.7
20
11
24
85
14
29
90
17
38
95
24,
56
mg/1
CEx sup.
4,5
6
7.4 8,8 10 12 14 16 18 22 26
31 38 47
62 86 130 220 490
Probit de la proportion inhibee en tonction du logarithme decimal de la concentration Methode par mesure de ia biomasse integrale -
0,000
0,200
0,400
0,600 0,800 1,000 1,200 1,400
Logarithme decimal de la concentration
1,600
1.800
2,000
Zs cteurrere ea rare wyes. II re ss-i esrs ri cope. ft ax's-irews a ass tars ss's auiorsaansarsssBE'ElfAlscrem. "
''^^S''? La recroj-iao-i 03 ce rzxw rffexg nes simnag sjs SOLS igne d tsosrss mss^sarexje r^3.-c3---?.Tg5y
tUtl6 -,' 42S5/93/A - RC342S5.DOC page ZSTZS
Sa"1"-"
Elf Atochem s. A. Centre d'Application de Levallois
TOXICITE CHRON1QUE VIS-A-VIS DES ALQUES Feuille de calcul des concentrations inhibitrices par la methode des Probits
Substance etudiee :
Date:|
06/11/98
Numero d'etude :
Initiales Technicien :\
CKE
Methode
Donnees utilisees pour Ie calcul
Concentration
nominale mg/1
Inhibition (Ip;)
(%)
corn gee
(%)
100 45,5 20,7 9.4 4,3 1,9
79.8 77:0'
55,7 18.7 16.9 -0.8
80 77 56 19 17 1 #N/A #N/A #N/A
nb valeurs
6
Somme Moyenne
parmesure dutaux de
PROBIT
y
log cone.
X
5.840 5:740
5,150 4,120 4,050 2,670 #N/A #N/A #N/A 27,570 4,595
r2=
2,000 1,658 1.316 0.973 0,633 0,279 #NOMBRE! #NOMBRE! fWMOMBRE!
6,859 1,143 0,933
croissance
Cone. Inhibitrices (CExr)
X
CEx,
CEx,
(%)
inf.
5
0.96
2.9
10
1.9
4,6
15
2,9
6,2
20
4.1
8
25
5,4
10
30
6,8
12
35
8,3
14
40
10
17
45
12
20
50
14
23
55
16
27
60
19
32
65
22
38
70
26
45
75
30
54
80
36
67
85
44
86
90
56
120
95
80
180
mg/l
CEx, sup.
5,4
8 10 13 17
20 24 30 37 45 56 69 89 110 150 200 300 480 960
Probit de la proportion inhibee en fonction du logarithme decimal de la concentration Methode par mesure du taux de croissance -
^"''\
0,000
0,200
0,400
0,600 0.800 1,000 1.200 1.400
Logarlthme dedrnsi de la concentration
1,600
1,800
2,000
3e cp~r"=~; ea nara ansni=. li re pa^ etre ri coas. re csTiTunn'p s d iiss sars ajCTSaxn esjiisss d3f AaKh"r:.
La rsx3aon os ce rEEoor. rfaids nes a^sisss aLE sexs wre se te-smte sfcECTasnious intsaai.
Eijde n' 42a5,'96/<< - ?;C34255.00C page 27/2^
LUiegTOl'eorta'mT^^68'
tir rtiocnem a. H. Centre d'Application de Levallois
9.4. Annexe 4 : Bulletin d'analvse de la substance Cette annexe est constituee d'un feuillet non pagine a la suite de la presente page.
^ ? ^ ^ ^ ^ e r w e 8 ^ ^ ^ ^ ^ Ce sssjmst es. rtxrs aroore. I! re osa SK ni coos. ni ssrmrcsjs c dss [srs, srs s'j!t3a-'EE5a3s=yn] ws!vsssssssa ?S" AA;;s-a-. L3 rearxsxxr, as ce rassa-i (l'"j3e r. es au[sris~ a'j sous roffne ds fes-sha s^accrasnous^ Etude r,' 42E5/3S/A - RC34255.DOC DOS SS.'2S
^----_---.-'.-MWKV^W
elf atochem
Z)
ElAbllBsement Villars el Paul IABORATOIRE CONTROLE / QUALIT
LCU PO 601 - ENR f39
REV: 2 CS-dfcW
Demands a'analyses r> "i'l20 Destinataires: M. DELAUNAY
M.DEU.ECASE M.GRUPPO
Conforme
NL01
Caract6hstiques
E:trall so
pH
MoBura d9 la danstta
Elhaitol
Folsonnement 6 0.5% ds eau de
vllls
DraliiaBfl S> a 0.5", ds eau J
<lla
Tenalon superfielalto
Pouvoir FlIinogAna
Sur Heptane: 3% cte mu da villa
Bulletin d'analyses produitfini
Unites
%
%
mn mN/m
Sp6clfications 27-28 6-9
1.08-1.05 =<2.S
>=6 >=3
<' 1S.5
Seconde
<=40
Date:
R6sultats 28.5.
29-rtal-98
Meth&de de contr6le
i."; LCU 622
B.5 1.081
0 LCU 642
/""
(".i LCU6C2
1.7 7.5 7mn"25s 15.9
18
(-: LCUS04
0
0 LCU 670
/-
-, /
i.
(") LCU S70
('.)
{'i LCUG03
(. ^
I: ; LCU 66S
C.'1
Q
i ;
Obssrvattons:
L'analyste DatB : 02-)un-Q8
0 -a-Ar--
^ '/l5
Le Responsable Lsboratoire
Date : 02-|un^9
Visa
4
Paga 'i sur '
Elf Atochem S. A. Centre d'Application de Levaliois
9.5. Annexe 5 : Bulletins d'analvses statistiques Cette annexe est constituee de 2 feuillets non pagines a la suite de la presente page.
CaoxLrnsTsaraRDnxt^.BreBe^arerscaps.reccmnTurKXsadsslisreQrss^ste^^
SwW^-00 '.3 reoro3Lt3CT', de ce raoart G'SLrie r.'sa autoress OLE SOLE fctme as tes-SBrs" uujxjw iiJJg iriKse. luoe r,- 42S3/3S/A . RC342e5.DOC page 2S/29 .g.Q^pany
^o0^81. ^1T' CfACBl
_Q^
Taux de croissance. definitif.
Cone.
-.^ = control
o,9 2 ^ 3
ii,l 4
3,4 5
Iqt 6* US;? 7* -w 8*
Summary Statistics and ANOVA
Transformation =
None
n
Mean
S.d.
3
.0592
.0009
3
..0599
.0030
3
.0590
.0057
3
.0466
.0118
3
.0463
.0093
3
.0256
.0051
3
.0133
.0037
3
.0119
.0016
cv%
1.5 5.0 9.6 25.2 20.1 19.9 27.6 13.5
the mean for this cone. is significantly less than the control mean at alpha =0.05 (1-sided) by Dunnett's test
Minimum detectable difference for Dunnett's test =
-.012977
'his difference corresponds to -21.92 percent of control
^ween concentrations
n of squares
=
.008740 with 7 degrees of freedom.
rror mean square =
.000039 with 16 degrees of freedom.
artlett's test p-value for equality of variances = .072
l)
-^w^iw'^1"^"' '-7'-' -'-, --'--- t'^-l
8
- .-..-.BftoICO^8'" "
Biomasse integrale. definitif.
Cone.
1 =
o,9
>,3
^
3,K
^,1
us-.s-
./IQO
control
2
3
4* 5* 6* 7* 8*
Summary Statistics and ANOVA
Transformation =
None
Mean
s.d.
3
10070.0000
644.4377
3
10540.0000
2568.4236
3
10216.6667
3696.0565
3
4976.6667
2960.6137
3
4740.0000
2282.3672
3
1440.0000
274.9545
3
744.0000
293.2030
3
420.0000
193.1217
cv%
6.4 24.4 36.2 59.5 48.2 19.1 39.4 46.0
*) the mean for this cone. is significantly less than the control mean at alpha = 0.05 (1-sided) by Dunnett's test
Minimum detectable difference for Dunnett's test =
-4362.417691
This difference corresponds to -43.32 percent of control
"otwee
^m of
n
s
c q
o u
ncen ares
t
r
a
t
i
=
o
ns 40
2
6
1
0
7
3
4
.
5
0
0
0
0
0
with
7 degrees of freedom.
Error mean square = 4355778.833333 with 16 degrees of freedom.
Bartlett's test p-value for equality of variances = .003
************************************************
*
*
* Warning - the test for equality of variances *
* is significant (p less than 0.01). The
*
* results of this analysis should be inter- *
* preted with caution.
*
*
*
************************************************
c