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Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.: ELFATOCHEM 04-Jul-95 95/SAEK/0489/AMP AR226-3021 Bacterial Growth Inhibition Author(s): Coil: H. Thiebaud A.M. Petit English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions Enterprise 27-Jan-03 Sanifesd. Does .noi contain' Company ELF ATOCHEM S.A. Levallois Applications Center TECHNICAL SUMMARY byj|BBH|j||was Determination of growth inhibition of Pseudomonas putida bacteria effected using the operating procedure described in proposed standard ISO/DIS 1^712 (of. doe "f18 Afnor T90B). The method consists in exposing the bacteria for 16 hours to a range of concentrations of the substance being studied. The inhibiting effect observed on Pseudomonas putida is determined by comparing the cell growth at various dilutions of the substance with the cell growth obtained for a culture under the same conditions but which does not contain the test substance. The cell growth is determined by turbidimetry using a spectrophotometer. The percent cell growth inhibition H is given by the relation : H=((Bk-Bn)/(Bk-BO))x100 where Bk and Bri are the turbidities, respectively, in the control and test flasks (after deduction of noninoculated whites) and BO is the turbidity at t = 0 in the control flasks. The inhibition values obtained during the preliminary test led us to effect a limit test at the single concentration of 100 mg/1. conditions.lUlflH^5 Under the test an inhibition of 14 % at a concentration of 100 mg/l. The CEso is consequently higher than 100 mg/l. The reference substance, 3,5-dichlorophenol, has a CEso -16 h equal to 17 mg/I and a CEio -16 h equal to 10 mg/i The validity criteria mentioning that the inoculum used in the control grew by at least a factor of 60X for the duration of the test was respected (growth factor 195). A. M. PETIT H.THIEBAUD TSCACSS Sanitised. Does not coniala Company ELF ATOCHEM S.A. D.C.R.D. Centre d'Application de Levaflois Service Anafyse Environnement . Levallois Ie: 04/07/95 Ref. document: 95/SAER/0489/AMP NdeSequentiei:814020 TITRE : DETERMINATION DE [.'INHIBITION DE LA CROISSANCE DES BACTERIES PSEUDOMONAS PUTIDA AUTEUR(S): H.THIEBAUD Coll. A. M. PETIT RESUME DOCUMENTAERE : ^lllBHIIlRj^ DetermmatiQc^eJ.inhibft.ion de !a croissance des bacteries Pseudomonas putida par suivan: ie mode operatoire decrit dans ia methode du projefae norme ISO/UIS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). Inhrbttion de ia croissance des bacteries Pseudomonas putida: DESTINATAIRE : M. DEVAUX (DCFS) Ce rapport comprend 3 pages et5 feuilfets non paginfe (feuilles de saisie, de calcul et representation graphique) Copies : Chef de Service, Responsable des Archives, Laboratoire d'ecotoxicofogie (copie coli.) Secretariat, Fichier TECH ";", c{iiL- Service Ecotoxicit0 et Sijretc des Produits (DSEP) y^ ^?SS 0 Ce documsn; es; is oroori6t ci'cLF ATOCHcM. II ns psut eirE n! copis. ni communique e oes tisrs sans sutorisstion former, G^ Ls reoroduction de cs raooon d'auds n'est autorises aus sous forme ds fec-simi!0 Bhotoaraohiaus inpgi^H, ' ' Q^^' R5PS2576.D6C Paos 1/3 CO1"? _., - " ELF ATOCHEM S.A. Centre d'Appiication de Levallois RESUME TECHNIQUE La del par le| projeffle ndrme ibition de la croissance des bacteries Pseudomonas putida Ja ete reaiisee en suivant Ie mode operatoire decrit dans Ie IS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). La methode consiste a exposer pendant 16 heures les bacteries a une gamme de concentrations de la substance etudiee. L'effet inhibiteur sur Pseudomonas putida est determine par comparaison de la croissance cellulaire des diverses dilutions de substance avec la croissance cellulaire obtenue pour une culture reaiisee dans les memes conditions mais ne contenant pas de substance d'essai. La croissance des bacteries est mesuree par turbidimetrie avec un spectrophotometre. Le pourcentage d'inhibition de la multiplication celiulaire, H, est donne par: H=((Bk-Bn)/(Bk-BO))x100 avec Bk et Bn, tes turbidites respectivement dans les flacons temoins et dans les flacons d'essai (apres deduction des blancs non inocuies) et BO, la turbidite a t = 0 dans les flacons temoins. Les vaieurs d'inhlbitions obtenues au cours de E'essai preiiminaire nous ont conduit a effectuer un essai (imite a la seuie concentration de 100 mg/1. Dans les conditions de ('etude, le^UHHBRpresente une inhibition de 14% a la concentration de 100 mg/I. La CE 50 est par consequent superieure a 100 mg/l. La substance de reference, Ie 3,5-dichlorophenol, presente une CE 50-16h egale a 17 mg/l et une CE io"16 n egale a 10 mg/l. Le critere de validite mentionnant que ['inoculum utilise dans le temoin s'est multiplie par au moins un facteur 60 pendant la duree de fossa' s ete respecte (facteur de croissance 195). ^ A. M. PETIT H. THIEBAUD Company SanitSzed. Does not contain TSCA CB? ;e aosumen; es; is proDri4 d'tLF AT03HEM i! ns peut Strs ni copi^, ni communique s ass tiers sans auiorisaiton forme'ls Ls rsDroaLiction ae ce raDOort d'aude n'est sLtahse aue sous ronne de fsc-simiis nhoiocTSOhiaue inteara!. REPS257S.DOC Paas 2,'3 ELF ATOCHEM S.A. Centre d'Application de Levallois Substance etudiee Substance de reference Demandeur de I'etude : Directeurde I'etude: Realisation technique: Date du debut de I'essai : Date de la redaction du rapport d'etude Mom _ Reference CAL Nom : 3-5 Dichforophenol Reference lot: Aldrich 97% 633 M. Devaux (DCFS) H.Thiebaud A. M. Petit 23/5/95 04/07/95 Preparation de I'echantiHon : Le jour de I'essai, une solution mere a 1 g/l dans Ie milieu d'essai est preparee. Mesures des pH: Concentration 0 mg/l 100 mg/l pH en debut d'essai 6,66 7,18 pH en fin d'essai 7,15 7,12 Orgamisme test: Pssudomonas pufida ; institut PASTEUR 103281 Materiel: Verrerie sterilisee (Eriens de 50 m!) SDectrophotometre Perkin -Elmer lambda 5 Agitateur thermostate 21 "C +/-1 C Gamme de concentrations: Solution mere ou solution mere diluee de la substance (facteur de dilution entre parentheses) Eau Milieu d'essai Inoculum Volume (ml) 1 0 7 8 1 1 1 1 Concentration (mg/() 100 ,,0^notCO? ... eonrtizeO. V^"- Cs dasLiment sst la Droprits d'ELF ATOCHEl'/,. ISns DSU: 6tre w copis, n! comRiuraaue a des tiers sans sutonsatior; fonnelie. LE repronLjctton de ce rapport d'6tudE n est auionse ous saus ronne de {ac-simii DhotogrsDhiqus integral. R5PS2576.DOC Pace 3,'S Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitjf, 16 n - M6thode decrite dans Ie projet de nonne ISO/DIS 10712 Feuilie de saisie des mesurages Substance etudiee : Norn : _ _ _ Ref. Cf Souche de Pseudomonas putida : institut Pasteur 103281 Turbidite de la preculture nombre de mesure absorbance (A436) 1 0,199 2 0.197 3 0,196 moyenne 0,197 FNU 50,60 50,08 49,83 50,17 Inoculum dans ie temoin Concentration mitiale (% vol) Tuifcidite initiate BO (A 436) Facteur de croissance observe pendant la duree de I'essai 10% 5,0 195 Concentration (mg/l) 0 (temoin) 100 Mesurage de facteur de dilution 0,04 0,10 I'absorbance Essais 1 0,169 0,324 (A436) en fin d'essai dans les series d'essai et Ie temoin Temoin 2 3 4 5 6 Substance 0,159 0,153 0,158 0,137 0,341 0,324 ^ainTSC ;;OW" sar"^.^Bot"'' /"" Essai d'inhibition de fa croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h Methode decrite dans Ie projet de nonne ISO/DIS 10712 Feuille de cafcui des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la methode des Probits Substance etudiee : Norn : Ref. CAL: Souche de Pseudomonas putida : Institut PasieuM 03281 Concentration (mg/t) 0 (temoin) 100 #N/A #N/A #N/A SH/A #N/A #N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0,155 0,330 #N/A #N/A #WA \I/A #N/A #N/A #N/A Turbidite moyenne (FNU moy) 980 840 #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A inhibition (%) 0,0 14,4 #N/A #N/A N/A IfN/A #WA #N/A #N/A CE50 = CE50> CE50< CE16 = CE10> CE10< r2= iSSNOMBRE! #NOIVIBRE! #NOMBRE! #NOMBRE! #NOMBRE! WOMBRB #IMOMBRE! mg/l mg/1 mg/1 mg/1 mg/l mg/l !#N/A : valeur non disponible. ( i#NOMBRE!: valeur indeterminee. Donnees utilisees pour Ie calcul (excluant Ie binome 0;0 du temoin) Concentration iInhihbitinon (mg/l) (%) coirigee P^R,~O--BiT y tog cone. x (%) 100 14.4 14.4 3,820 2.000 #N/A #WA #NQMBRE! #N./A #WA #NOMBRE! #N/A '#N./A SOMBRE! #N/A #N/A SOMBRE! #N/A #WA iSENOMBRE! m//\ #N/A #N/A #WA #NOMBRE! #NOMBRE! IfN/A #N/A #NOMBRE! nb valeurs 1 Somme Moyenne 3,920 3,920 2,000 2,000 nQtcQalata-rS^^1 ^^QQGS Essai d'inhibition de fa croissance de Pseudomonas putida - Essai definiti'f, 16 h Mffhode d&rite dans Ie projet de norme ISO/DIS 10712 Feuille de saisie des mesurages Substance etudiee : JNom: 3-5 Dichiorophenol |Ref. CAL Aldrich 97% 633 Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Turbidite de la precuiture nombre de absorbance mesure (A436) 1 0,199 2 0,197 3 0,196 moyenne 0,197 FNL) 50,60 50,08 49,83 50,17 Inoculum dans Ie temoin Concentration initiate (% vol): Turbidite initiate BO (A 436): Facteur de croissance observe pendant la duree de I'essai: 10% 5,0 195 Concentration Mesurage de I'absorbance (A436) en fin d'essai dans les series d'essai et Ie temoin (mg/l) facteurde E-s-s-a-is- Temoin dilution 1 2 3 4 5 6 Substance 0 (temoin) 0,04 0,169 0,159 0,153 0,158 0,137 30 1,00 0,476 0,439 0,504 25 1,00 0.755 0.736 0,100 20 0.20 0.155 0.141 0.158 ^ 15 0,20 0,458 0,431 0,433 10 0,10 0,341 0.376 0,373 notco"n1iainTS A.500S Saw.^' COWP^ Essai d'inhibition de (a croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h Mahode d6crite dans Ie projet de nonne ISO/DIS 10712 Feuille de calcul des pourcerstages d'inhibition et des concentrations efficaces par I methode des Probits Substance etudiee : iNom : 3-5 Dichlorophenol Ref. CAL: Aldrich 97% 633 Souche de Pseudomonas putida : Ihstitut Pasteur 103281 Concentration (mg/l) 0 (temoin) 30 25 20 15 10 #N/A #N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0.155 0,473 0,530 0,151 0,441 0,363 #N/A #N/A #WA Turbidite moyenne (FNU moy) 980 120 140 190 560 930 #N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 88,2 86,2 81,0 43,1 5,1 #N/A #N/A #N/A CE50 = CE50 > CE50< CE10 = CE10> CE10< r2= 17 13 21 10 5,6 13 0,932 mg/l mg/l mg/i mg/l mg/l mg/l #N/A : valeur non disponible. | #NOMBRE!: valeur indeterminee. Donnees utilisees pour Ie calcul (excluant Ie binome 0;0 du temoin) Concentration i'n"hilb^i"iio~n" (mg/l) (%) comgee (%) PROBfT y log cone. x 30 88,2 88.2 6.180 1,477 25 86,2 86,2 6,080 1,398 20 81,0 8-i.O 5,880 1,301 15 43,1 43.1 4,820 1,176 10 5,1 5,1 3.360 1.000 #N/A ^N/A #NOIVESREi #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! IfN/A tfWA #MOM8RE! nb valeurs 5 Somme Moyenne 26,320 5,264 6,352 1,270 ^O^?'5'-'"1 . .rSCi^- ,, no5'-----" iSafMtlAlS^O^""-'^----"" 3 : Probit de fa proportion inhsbee en fonction du logarithme decimal de la concentration |Aldrich97%| Valeurs experimentales Droite calculee 4- 2,000 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 Logarithms decimal de la concentration 1,400 1,600