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Study Sponsor: Issue D ate: Docum ent R eferen ce No.: E L F A TO C H E M S .A . 10-NO V-95 9 5/S A E 6/1205/H T AR226-3032 \ Acute Toxicity to D aphnia Author(s): H. Thiebaud Coll. P. Brochier English Translation of R eport Sum m ary for D uP ont C hem ical Solutions E nterprise 2 7 -J a n -0 3 Does not contain TSCA C TECHNICAL SUMMARY Determination of acute toxicity (inhibition of mobility) of Daphnia magna 24 and 48 hours was effected using the operating procedure described in standard ISO 6341 applicable to chemical substances, industrial and urban effluents, to surface and subterranean waters. This method differs from method 6 .2 in appendix il of the European directive 92/69/EEC since it does not require that the nominal concentrations of the substance be verified by analysis. The method consists in exposing the daphnias to a range of concentrations of the substance being studied. The toxic effect observed is the immobilization at the end of 24 and 48 hours. From the dose/effect relation established with the initial concentrations, a median effective CE(I)50 is calculated, expressed as CE(I)50 - 24 h and CE(I)50 - 48 h. Under the study c o n d M o n s |B H B B H H M M > resents a CE(I)50 - 24 h which is above the highest concentration tested (200 mg/I) and CE(I)S0- 48 h of 100 mg/1 with a confidence interval at 95 % = 95 mg/l to 110 mg/l. 2 S IGNATURE Director of the study: H. THIEBAUD Date Signature 12/11/95 Technician who carried out the study: P. BROCHIER Date Signature 16/11/95 Cwipany Sanitized. Does not contain TSCA G& Elf Atochem S.A. DCRD Centre (l'Application de Levallois Service Analyse Environnement Levallois, le 10/11/95 R frence : 95/S A E 6/1205/H T Squentiel : 814020 RAPPORT D'ETUDE T IT R E : f l H H H H t f t o K I C n ' AIGU VIS- -VIS D ES DAPHNIES A U TE U R (S) : H. THIBAUD ; Coll. P. BROCHIER RESUM E D O CUM ENTAIRE : D te rm in a tjo ^ l^ ^ o x jc it aigu (inhibition de la mobilit) de Daphnia m agna par l e H P H H H H B u r 2 4 et 48 heures, en suivant le mode opratoire dcrit clans la norme ISCX6341 (seconde dition, 1989). oxicit aigu daphnies, ISO 6341. DESTINATAIRES : M. DEVAUX (D C FS) DO C FIC H IER TECH (M. TAISNE) Copies : C hef de Service, Responsable des Archives, Secrtariat, Service cotoxicit et Sret des Produits (DSE-P) ys Sanitized, Does not contain TSGAGBP C e docum ent e s t notre proprit. I n e p e u t tre r i copi, r i com m uniqu d e s Sers s a n s autorisation expresse c fB ffito c h e m . RESUME TECHNIQUE 2/13 ^ La dtenmination de la toxicit aigu (inhibition de la mobilit) de Daphnia magna par le 1m H H H H H P s u r 24 et 48 heures a t ralise en suivant le mode opratoire dcrit dans la norme ISO 6341 applicable aux substances chimiques, aux effluents indiicfriels et urbains, aux eaux de surfaces et souterraines. Cette mthode diffre de la mthode C.2 de l'annexe II la directive europenne 92/69/CEE car elle ne ncessite pas que les concentrations nominales en substance soient vrifies par analyse La mthode consiste exposer les daphnies une gamme de concentrations de la substance tudie. L'effet toxique observ est l'immobilisation au bout de 24 heures et 48 heures. A partir de la relation dose/effet tablie avec les concentrations initiales, on dduit une concentration mdiane effective CE(I)50, exprime en CE(I)50 - 24 h et CEO)TM -4 8 h .................................. ............................. Dans les conditions de l'tude, l e ( H B H H H B H > r& ente une C E(I)S0 - 24 h suprieure la plus forte concentration teste (200 mgflj et une CE(I)50 - 48 h de 100 mg/I avec un intervalle de confiance 95 % de 95 mg/I 110 mg/1. Le Directeur de l'tude : H. THTBAIJD La Technicienne charge de l'tude : P. BROCHIER Date k M lM jV Signature S" " 2" - t n TSCA CB, C e docum ente s t n o te proprit. Une p e u t tre n i copi, n i com m uniqu d e s Sers s an s autorisation expresse d B fA to c h e m . 3/13 RAPPORT D'ETUDE L TOXICITE AI' VIS-A-VIS DES D1 APHNIES. 1. IDENTIFICATIONS 1.1. Substance d'essai 1.2. Laboratoire d'essai SO M M A IR E ------------------------ 1.4. Calendrier 2. OBJECTIF DE L'TUDE 3. MTHODE D'ESSAI 3.1. Introduction 3.1.1. Principe 3.1.2. Rfrences 3.1.3. Dviations 3.2. Matriel et produits 3.2.1. M atriel 3.2.2. Produits et ractifs 3.3. Mode opratoire 3.3.1. Prparation des solutions 3.3.2. Essai prliminaire 3.3.3. Mthode d'analyse 3.3.4. Essai dfinitif _ 3.3.5. Contrle de.sensibilit du ractif biologique 4. RSULTATS 4.1. Essai dfinitif 4.2. Critres de Validit de l'tude 4.2.1. Teneur en oxygne 4.2.2. Immobilisation des tmoins 4.2.3. Sensibilit du ractif biologique 5. CONCLUSIONS 6. ANNEXES 6.1. Annexe 1 : Milieu d'essai. 6.2. Annexe 2 : Concentrations utilises et rsultats des calculs 24 heures 6.3. Annexe 3 : Concentrations utiliseset rsultats des calculs 48 heures 4 4 4 5 5 5 5 5 6 5 g g g 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 g 10 10 11 12 Company Sanitized. Does not contain TSCA CBH Ce documentestnoteproprit. In e peuttre nicopi, n communiqu desSetssansautorisationexpresse cfSAtochem. RC26349.DOC page 3/13 1. IDENTIFICATIONS 1.1. SUBSTANCE D 'ESSAI Dnomination N d'enregistrement Caractristiques principales : - apparence : liquide brun - solubilit dans l'eau : totalement soluble Prcaution d'emploi et de conservation : voir la FDS 1.2. LABORATOIRE D'ESSAI ELF ATOCHEM CENTRE D'APPLICATION DE LEVALLOIS SERVICE ANALYSE ENVIRONNEMENT 95 rue Danton - 92300 LEVALLOIS-PERRET Directeur d'tude M. THIBAUD Personnel impliqu dans l'tude Ingnieur : M. THIBAUD Technicienne : Mlle BROCHEER 4/13 Compaq Saniiized. Doesnotcontain TSCACM Ce documentestnotreproprit. ! nepeuttre nicopi, nicommuniqu desSerssansautorisaSon expresse dBfAiochem. D/^n-eoAn r \ r \ r * a /An 5/13 1.3. DEMANDEUR DE L'ETUDE M. DEVAUX (DCFS) 1.4. CALENDRIER Dbut de l'tude Fin de l'tude Rapport d'tude 2/10/95 11/10/95 10/11/95 2. O BJECTIF DE L'TU D E L'objectif de cette tude _ejt de dterminer la joxicit aigu (inhibition de la mobilit) vis--vis des daphnies d u ^ P H I H H H H B c n suivant le mode opratoire dcrit dans la norme ISO 6341 (seconde dition, 198$^ Cette norme s'applique aux substances chimiques, aux effluents industriels et urbains, aux eaux de surfaces et souterraines. 3. MTHODE D 'ESSAI 3.1. INTRODUCTION 3.1.1. PRINCIPE -- Les daphnies sont exposes la substance d'essai ajoute l'eau, dans une srie de concentrations donne, pendant une priode de 24 heures et ventuellement 48 heures, sans renouvellement des concentrations d'essai. Dans des conditions identiques et pour une gamme de concentrations adquate (dfinie au moyen d'un essai prliminaire), des concentrations diffrentes en substance d'essai ont des effets diffrents sur la capacit de nage des daphnies. En consquence, en fin . d'essai, chaque concentration correspond un pourcentage diffrent d'immobilisation des daphnies. Les concentrations initiales provoquant 0 et 100 % d'immobilisation sont dtermines directement par l'observation. La concentration initiale efficace inhibitrice immobilisant en 24 heures 50 % des daphnies mises en exprimentation, dsigne CE(I)50 - 24 h, est dtermine par calcul. La CE(I)50 - 48 h est ventuellement dtermine par la mme mthode. , L'tude est conduite en deux tapes : - un essai prliminaire qui sert dterminer la gamme des concentrations pour l'essai dfinitif. - un essai dfinitif dont seul le rsultat est retenu : CE(I)50 - 24 h et ventuellement CE(I)50 - 48 h. Gompmy Sanitized. Does net gantai t s c a e^ j Ce documentestnotreproprit. I nepeuttre r i copi, r i communiqu desSerssans autorisaSonexpresse dBfAtochem. 6/13 On constate au cours de l'essai prliminaire, que seule la concentration 100 mg/1 montre une toxicit pour les daphnies significative aprs 48 heures. Un essai dfintif est ralis dans la gamme de concentration : 53,9 200 mg/1. L M M M M ^ t a n t un mlange de plusieurs substances pouvant voluer diffremment, les rsultats sont exprims par rapport aux concentrations nominales (mg/1) de la prparation, considres quivalentes aux concentrations initiales. Les pourcentages d'immobilisation en fonction des concentrations initiales, 24 et ventuellement 48 heures, sont utiliss pour calculer, l'aide d'un programme informatique appropri, la CE(I)50 ( 24 heures et ventuellement 48 heures). Les intervalles de confiance 95 % sont, si possible, dtermins par le calcul. 3.1.2. REFERENCES - Norme Intemationae ISO 6341, Qualit des eaux - Dtermination de l'inhibition de la mobilit de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), seconde dition du 01/10/89. 3.1.3. DEVIATIONS 3.2. M ATERIEL ET PRODUITS 3.2.1. MATERIEL L'tude a t ralise dans une salle thermostate une temprature comprise entre 20 et 21 C. Les paramtres physico-chimiques ont t mesurs au moyen d'un combin multifonctions JENWAY 3410 (oxymtre, conductimtre, pHmtre). Les daphnies {Daphnia magna Straus) utilises proviennent d'un levage ralis dans le laboratoire. La slection d'organismes gs de moins de 24 heures s'effectue par tamrsage (toile bluter mailles de 0,56 mm). La composition du milieu d'essai est dtaille en annexe 1. ` Les rcipients pour essai sont des bchers de capacit nominale de 250 ml. 3.2.2. PRODUITS ET REACTIFS - Eau : pour la prparation des solutions mres du milieu d'essai, il est fait usage d'eau ultrapure (ultrafiltration, charbon actif, change d'ions, filtre 0,22 pm) ; de mme, pour Sm ^ Ce documentestnotreproprit. Snepeuttre nicopi, nicanrrmnkpu des Serssansautorisationexpresse dBfAtochem. ` < *( ,, T8CA c a , 7/13 la ralisation du milieu d'essai (eau de dilution) les solutions mres sont dilues dans de l'eau ultrapure. - Les ractifs utiliss pour la prparation de l'eau de dilution (voir annexe 1) sont de qualit "pour analyse". 3.3. MODE OPERATOIRE 3.3.1. PREPARATION DES SOLUTIONS Une solution d e ^ H H H H H H ^ lm is le milieu d'essai 100 mg/1 est prpare le jour de l'essai prliminaire, et 200 mg/1 le jour de l'essai dfinitif. 3.3.2. ESSAI PRELIMINAIRE Des volumes adquats de la solution mre da rcipients et complts 200 ml par de Teai de dilution poi concentrations allant de : 0,1 100 mg/1 ;ont verss dans les tenir la gamme de 10 daphnies ges de moins de 24 heures sont ajoutes dans chaque rcipient d'essai puis ceux-ci sont placs l'obscurit dans la salle thermostate. Au bout de 24 heures, les daphnies encore mobiles sont dnombres, bchers sont replacs l'obscurit puis un deuxime dnombrement est ralis 48 heures aprs le dbut de l'essai. Les rsultats obtenus servent dfinir la gamme de concentration de l'essai dfinitif. 3.3.3. ESSAI DEFINITIF On procde des dilutions de la solution mre dans de l 'eau de dilution pour raliser la gamme de concentrations ncessaire la ralisation de l'essai dfinitif. Les diffrentes concentrations de cette gamme sont donnes dans les annexes 2 et 3. 2 bchers de 10 daphnies ges de moins de 24 heures sont prpars pour chaque concentration et pour le tmoin. Au bout de 24 heures, les daphnies encore mobiles sont dnombres, les rcipients sont replacs l'obscurit puis un deuxime dnombrement est ralis 48 heures aprs le dbut de l'essai. 3.3.4. CONTROLE DE SENSIBILITE DU REACTIF BIOLOGIQUE Priodiquement, et selon le mme mode opratoire, la CE(I)S0 - 24h du dichromate de potassium est dtermine afin de contrler la sensibilit des organismes. Company Sanftlzed. Ce docum ente s t notre proprit. U ne p e u t tre n i copi, n i com m uniqu d e s tiers s a n s autorisathn expresse d B fA to c h e m . B rO R 'A Q n n n n a n o 7/10 oesnof contain TSCA CE, 8/13 4. RSULTATS 4.1. ESSAI D EFIN ITIF Les rsultats obtenus dans l'essai sont rassembls dans les tableaux en annexe 2 (rsultats 24 heures) et en annexe 3 (rsultats 48 heures). La partie suprieure montre les donnes brutes obtenues ; les concentrations utilises pour les calculs sont indiques en dessous. Aprs linarisation au moyen de la mthode des Probits, on obtient les rsultats suivants : Aprs 24h, la plus forte concentration teste (200 mg/1) ne montre pas de toxicit significative du FORAFAC 1157 N vis--vis des daphnies. La CE 50-24h est donc suprieure cette concentration ; Aprs 48h, les rsultats permettent le calcul d'une CE 50-48h gale 100 mg/1, avec un intervalle de confiance 95 % gal : 95 -110 mg/1 (r2 = 0,981). Le pH initial la concentration la plus leve tait de 7,66. Le tableau ci-dessous donne les rsultats des mesures d '0 2 et de pH ralises aux diffrentes concentrations : Concentration nominale (mg/1) 0 53,9 70,0 91,0 118,3 153,8 200 O2 48h (mg/1) pH 48 h 8,5 8,4 8,3 8,3 . 8,2 _ 8'3 8,2 7,72 7,67 7,63 7,65 7,65 7,65 7,61 4.2. CRITERES DE VALIDITE DE L'ETUDE 4.2.1. TENEUR EN OXYGENE chaque concentration, la teneur en oxygne dissous, mesure en fin d'essai, est suprieure ou gale 2 mg/1. 4.2.2. IMMOBILISATION DES TEMOINS L'immobilisation au bout de 48 heures dans la'srie tmoin est de 5 %. La clause requrant une mortalit infrieure ou gale 10 % en fin d'essai a donc t respecte. 4.2.3. SENSIBILITE DU REACTIF BIOLOGIQUE Le dernier contrle de la sensibilit des daphnies au dichromate de potassium a t ralis le 06/09/95. La CE(I)50 - 24 h de cette substance de rfrence, value 0,94 mg/I, tait comprise entre 0,9 mg/1 et 2,4 mg/1 qui est la gamme acceptable ( 9.2 de la norme ISO 6341). ^ y S a n ife e c t Ce documentestnotreproprit, ne peuttre nicopi, nicommuniqu des Serssansautorisation expresse dBffilochem. * * *1 conta, TSCA c m 9/13 5. CONCLUSIONS L'tude de la toxicit aigu ^ L j s - - v i s de la daphnie montre que cette substance prsente une C(I)5o - 24 h suprieure 200 mg/1 et une CE(I)5n- 48 h gale 100 mg/1 avec un intervalle de confiance 95 % de 95 mg/1 110 mg/1. Ce documentestnotreproprit. Unepeutt r icopi, nicommuniqu des Serssansautorisationexpresse dBfAtochem. D r'O tn A Q r% r\rt n a m o /fo 10/13 6. ANNEXES ' 6.1. ANNEXE 1 : M ILIEU D'ESSAI. L'eau de dilution (ou milieu d'essai) est prpare de la faon dcrite dans la norme ISO 6341 : - les solutions mres suivantes sont prpares : ' 11,76 g de CaCl2,2 H 20 par litre d'eau ultrapure, 4,93 g de M gS04, 7H20 par litre d'eau,ultrapure, 2,59 g de NaHC03par litre d'eau ultrapure, 0,23 g de KC1 par litre d'eau ultrapure. - l'eau de dilution est obtenue partir de 25 ml de chacune de ces solutions par litre d'eau, puis aration jusqu' saturation en oxygne. Ce docum ent e s t n o te proprit, lin e p e u t t n icopi, n i com m uniqu d e s tiers s an s autorisation exp resse d B fA to ch em . 0083 m contafn TSCA CBt 11/13 6.2: ANNEXE 2 : CONCENTRATIONS UTILISEES ET RESULTATS DES CALCULS A 24 HEURES TOXICIT AIGU VIS--VIS DES DAPHNIES Calcul de la CE50 par la mthode du Probit chantilloi n d'tude :l6349/95/A Mthode applique : ISO 6341 Essai dfinitif, 24 heures Conc. en substance mg/l 200 153,8 118,3 91 70 53,9 0 (tmoin) 0 (solvant) Daphnies par concentration : [ 20 % IMMO 10 0 0 5 5 0 100 100 100 100 100 0 100 Nombre de daphnies mobiles Rcipient 1 10 10 10 9 9 10 Rcipient 2 8 10 10 10 10 10 Rcipient 3 | Rcipient 4 total 18 20 20 19 19 20 0 0 -0 0 10 10 0 20 0 _ Sanitized. Does not contain TSCA CBt C e docum ent e s t n o ie proprit. Il n e p e u t tre r copi, r com m uniqu d e s Sers s a n s autorisaton expresse d B fA to c h e m . 12/13 6.3. ANNEXE 3 : CONCENTRATIONS UTILISEES ET RESULTATS DES CALCULS A 48 HEURES TOXICIT AIGU VIS--VIS DES DAPHNIES Calcul de la CE50 par la mthode du Probit chantillon] n d'tude : I6349/95/A a Mthode applique : ISO 6341 Essai dfinitif, 48 heures Cohc. en substance mg/l 200 153,8 118,3 91 70 53,9 0 (tmoin) 0 (solvant) Daphnies par concentration : | 20 % IMMO 95 75 60 45 20 5 100 100 100 100 100 5 100 Nombre de daphnies mobiles Rcipient 1 | Rcipient 2 Rcipient 3 Rcipient 4 | ,1 0 32 44 56 88 9 10 9 10 total 1 5 8 11 16 19 0 0 0 0 0 19 0 CE50 = CE 50 > CE50 < r2 = 100 95 110 0,981 m g/l mg/l mg/l Donnes utilises pour le calcul concentration 200 153,8 118,3 91 70 53,9 % IMMO 95 75 60 45 20 5 nb valeurs 6 #N/A : valeur non disponible. fNOMBRE! : valeur indtermine. % IMMO corrige 95 75 60 45 20 5 #N/A #N/A #N/A fN /A Somme Moyenne PROBIT log conc. y 6,640 5,670 X 2,301 2,187 5,250 4,870 , 2,073 1,959 4,160 3,360 1,845 1,732 #N/A #N/A fNOMBRE! fNOMBRE! #N/A fNOMBRE! #N/A fNOMBRE! 29,950 4,992 12,097 2,016 Company Sanitized. Does not contain TSCA C Ce docum ent e s tn otre p roprit. I n e p e u t tre n icopi, n icom m uniqu d e s Sers san s autorisation expresse d B fA to c h e m . 13/13 Calcul de la CE50 48h selon la mthode du Probit -- 7,000 Valeurs esqjrimentales -------- Droite calcule - - 6,000 5,000 4,000 3,000 " 2,000 1,000 0,000 0,500 1,000 1,500 log dcimal de la concentration 2,000 0,000 2,500 Sanfzed. B@es nos eontain TSCA C Ce docum ent e s t notre proprit. I n e p e u t tre r i copi, r i com m uniqu d e s Sers s a n s autorisa&m expresse d B fA to c h e m .