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AR226-3010 Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.: ELF ATOCHEM 06-Mar-05 59198 Determination of Bacterial Inhibition in Pseudomonas Putida Author(s): H. Thiebaud Coll A.M. Petit English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions. Enterprise 27-Jan-03 Sanitized. ELF ATOCHEM Levallois Applications Center TECHNICAL SUMMARY b^fffUKqwas Determination of growth inhibition of Pseudomonas putida bacteria effected using the operating procedure described in proposed standard ISO/DIST0712 (cf. doc 1ITOfnor T90B). The method consists in exposing the bacteria for 16 hours to a range of concentrations of the substance being studied. The inhibiting effect observed on Pseudomonas putida is determined by comparing the cell growth at various dilutions of the substance with the cell growth obtained for a culture under the same conditions but which does not contain the test substance. The cell growth is determined by turbidimetry using a spectrophotometer. The percent cell growth inhibition H is given by the relation : H=((Bk-Bn)/(Bk-BO))x100 where Bk and Bn are the turbidities, respectively, in the control and test flasks (after deduction of non- inoculated whites) and BO is the turbidity a^t =: 0 in the control flasks. Under the test conditions^fUf------presents a : CEso -16 h = 18 mg/1, with a confidence interval at 95 % = 14 - 24 mg/1 and a CEio -16 h = 5.5 rng/l, with a confidence interval at 95 % = 3 - 8.1 mg/l The reference substance^B------BBlJjha aCsEso -16 h equal to 16 mg/l and a CEio -16 h equal to 10 mg/l ^^^^^^^^1 The validity criteria mentioning that the inoculum used in the control grew by at least a factor of 60X for the duration of the test was respected (growth factor = 127). A. M. PETIT H. THIEBAUD Translation: Language Services Running Fox Technologies, Inc. A. Z. Fresco : 1/24/03 C.?w%~,s Sanitized. Does not contain TSCA CB8 ELF ATOCHEM D.C.R.D. Centre d'Application de Levallois Service Analyse Environnement Levallois Ie: 06/03/95 Ref. document: 58198 N de Sequentiel: 814020 TITRE : DETERMINATION DE L'iNHlBITION DE LA CROISSANCE DES BACTERIES PSEUDOMONAS PUTIDA AUTEUR(S): H.THIEBAUD Coll. A. M. PETIT RESUME DOCUMENTAIRE : Determination de I'inhibmon de la croissance des bacteries Pseudomonas putida par lefflBMHHHH^pn suivant Ie mode operatoire decrit dans la methods du projet de norme ISO/DIS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). '0/DIS10712 |lnhibition de la croissance des bacteries Pseudomonas putida', DESTINATAIRE : M. BLANDEL (DCFS) Ce rapport comprend 3 pages et 6 feuiltets non paginfe (feuilles de saisie, de calcul et representation graphique) Copies : Chef de Service, Responsable des Archives, Laboratoire d'ecotoxicologie (copie coll.) Secretariat, Fichier TECH Service Ecotoxicite et Surete des Produits (DSEP) Ce document est la propriete d'ELF ATOCHErA II ne peut etre ni copie, ni communique A des tiers sans autorisation formelle. La reproduction de ce rapport d'etude n'est autorisee que sous forme de fsc-simile photographique integral, REPS4820.DOC Page 1/3 ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levaliois RESUME TECHNIQUE La determination de I'ipNbition de la croissance des bacteries Pseudomonas putida par I^IIII--------I^HBete reaiisee en suivant Ie mode operatoire decrit dans Ie projetdenbrTnei50/Diyi0712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). La methode consiste a exposer pendant 16 heures les bacteries a une gamme de concentrations de la substance etudiee. L'effet inhibiteur sur Pseudomonas putida est determine par comparaison de la croissance cellulaire des diverses dilutions de substance avec la croissance cellulaire obtenue pour une culture reaiisee dans les memes conditions mais ne contenant pas de substance d'essai. La croissance des bacteries est mesuree par turbidimetrie avec un spectrophotometre. Le pourcentage d'inhibition de la multiplication celffilaire, H, est donne par: H=((Bk-Bn)/(Bk-BO))>;100 avec Bk et Bn, Jes-turhiditesjiesRectiyement dans les flacons temoins et dans les flacons d'essai (apres deduction des blancs non inocules) et BO, la turbidite a t = 0 dans les flacons temoins"----....-.__,,.__,,___..-.-- ---""" Dans ies conditions de I'etude, lell^--------^fpresente une : CE 5o-16h = 18 mg/l, avec un intervalle de confiance a 95 % egal a 14 - 24 mg/l, etune CE io'1 h = 5,5 mg/l, avec un intervalle de confiance a 95 % egal a 3 - 8,1 mg/l. ^ -- lerX-f_B_--_--__--_--__------, Jpresente CE La substance de reference, une 5o-16h egale a 16 mg/l et une CE.io-16 h egaiea10mg7^^^^ ^ '. ! Le critere de validite mentionnant que I'inoculum utilise dans le temoin s'est multiplie par au moins un facteur 60 pendant la duree de I'essai a ete respecte (facteur de '^ croissance = 127). A, M. PETIT C^-^-"- 1 H. THIE8AUD Ce document est la propn6te d'ELF ATOCHEM. II ne peut @tre ni copifi, ni communique a des tiers sans autorisation formelle La reproductinn de ce rapport d'etude n'est autorisee que sous forme de fac-simiie photographique integral REPS4820.DOC Page 2/3 Sanilized. nal conSain TSC& ^RI ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levallois Substance etudiee Substance de reference Demandeur de I'etude: Directeur de I'etude: Realisation technique: Date du debut de I'essai: Date de la redaction du rapport d'etude : Reference CAL: 4820/94 Nom^--------W----U Reference CAL (lot): Aldrich 97% 633 M. BLANDEL (DCFS) H. TH1EBAUD A. M. PETIT 16/11/94 06/03/95 Preparation de 1'echantillon: Le jour de I'essai, une solution mere a 500 mg/l dans le milieu d'essai est preparee. Mesures des pH : Concentration 0 mg/l 100 mg/l pH en debut d'essai 6.95 6,90 phi en fin d'essai 6,01 5,90 Orgamisme test: Pseudomonas putida ; Institut PASTEUR 103281 Materiel: Gamme de concentrations : Verrerie sterilisee (Eriens de 10 ml) Spectrophotometre Perkin -Elmer lambda 5 Agitateur thermostats 21 C +/-1 C Volume (ml) Solution mere ou solution mere diluee de la 2 substance (facteur de dilution entre parentheses) 1 0,5 2,5 1,25 0 (1/10) 1/10) Eau 6 7 7,5 5,5 6,75 8 Milieu d'essai 1 1 1 1 1 1 Inoculum 1 1 1 1 1 1 Concentration (mg/l) 100 | 50 25 12,5 6,25 0 Ce document est la propriete d'ELF ATOCHEM. II ne peut etre ni copie, ni communique S des tiers sans autorisation fonnelle. La reproduction de ce rapport d'etude n'est autorisee que sous forme de fac-simile photographique integral. REPS4820.DOC Page 3/3 Sanitizacl. not contain T8CA CBI Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h Methods dfcrite dans Ie projet de nonne ISO/D1S 10712 Feuille de saisie des mesurages Substance etudiee : Ref. CAL: 4820/93 Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Turbidite de la preculture nombre de mesure absorbance (A436) 1 2 3 moyenne #DIV/0! PNU #N/A #N/A #N/A #DIV/0! Inoculum dans Ie temoin Concentration initiale (% vol): Turbidite initiale BO (A 436): Facteur de croissance observe pendant la duree de I'essai: 10% 6,4 127 Concentration (mg/l) 0 (temoin) 6,25 12,5 25 50 100 Mesurage de facteur de dilution 0,04 0,05 0,05 0,05 0,10 1,00 I'absorbance Essais 1 0,120 0,150 0,119 0,048 0,069 0.116 (A436) en fin d'essai dans les series d'essai 2 0,125 0,125 0,104 0,041 0,052 0,104 3 0,116 0,134 0,079 0,041 0,064 0,125 4 0,122 5 0,135 et Ie temoin 6 ' Company o@98 not contain TSCA C8I Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas piitida - Essai definitif, 16 h Methods dficrite dans Ie prolet de nonne ISO/DIS 10712 Peuiile de calcui des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la methods des Probits Substance etudiee : ^ Ref. CAL: 4820/93 Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 [] Concentration (mg/l) 0 (temoin) 6,25 12,5 25 50 100 #N/A #N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0,124 0,136 0,101 0,043 0,062 0,115 #N/A #N/A #N/A Turbidite moyenne (FNU moy) 810 710 530 240 170 30 #N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 12,4 34,8 70,9 79,6 97,1 #N/A #N/A #N/A CE50 = CE50> CE50< CE10 = CE10> CE10< r2= 18 14 24 5,5 3 8,1 0,980 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l |#N/A : valeur non disponible. [ I#NOMBRE!: valeur indeterminee. Donnees utilisees pour Ie calcui (excluant Ie binome 0;0 du temoin) Concentration Inhibition PROBIT log cone. (mg/l) (%) comgee y x (%) 6,25 12,4 12,4 3,820 0,796 12,5 25 - 50 100 34,8 70,9 79,6 97,1 34,8 70,9 79,6 97,1 #N/A #N/A #N/A #N/A 4,590 5,520 5,810 6,880 #N/A #N/A #N/A #N/A 1,097 1,398' 1,699. 2,000 #NOMBRE! #NOMBRE! #NOMBRE! #NOMBRE! nbvaleurs 5 Somme Moyenne 26,620 5,324 6,990 1,398 Company not contain TSCA CB? Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h Mahode decrite dans Ie projetde nonne ISO/DIS 10712 Feuille de saisie des mesurages Substance etudiee: 6 & Ref. CAL: SUBSTANCE DE REFERENCE -ALDRICH- Souche de Pseudomonas putida : Institirt Pasteur 103281 Turbidite de la preculture nombre de mesure absorbance (A436) 1 2 3 moyenne #DIV/0! PNU #N/A #N/A #N/A #DIV/0! Inoculum dans Ie temoin Concentration initiale (% vol): Turbidite initiale BO (A 436): Facteur de croissance observe pendant la duree de I'essai: 10% 6,4 127 Concentration Mesurage de I'absorbance (A436) en fin d'essai dans les series d'essai et Ie temoin (mg/l) facteur de Essais dilution 1 2 3 4 5 6 0 (temoin) 0,04 0,125 0,116 0,122 0,125 0,135 10 0.04 0,115 0,133 0,097 15 0,07 0,063 0,096 0,066 20 0,10 0,119 0,126 0,122 25 0,20 0,117 0,164 0,166 30 1,00 0,021 0,035 0,035 Company SanitizeA Qiaes not contain TSCA CB? Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h Methode decrite dans Ie projet de norme ISO/DIS 10712 Feuille de caicul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la methods des Probits A Substance etudlee: Ref. CAL: SUBSTANCE DE REFERENCE -ALDR1CH Souche de Pseudomonas putida: institut Pasteur 103281 Concentration (mg/1) 0 (temoin) 10 15 20 25 30 #N/A #N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0,125 0,115 0,075 0,122 0,149 0,030 #N/A #N/A #N/A Turbidite moyenne (FNU moy) 810 750 300 320 190 8,7 #N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 7,5 63,5 61,0 77,2 99,7 #N/A #N/A #N/A CE50 = CE50> CE50< CE10 = CE10> CE10< r2= 16 8,5 22 10 2 14 0,864 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1 #N/A : valeur non disponible. | #NOMBRE!: valeur indeterminee. Donnees utilisees pour Ie caicul (excluant Ie bin6me 0;0 du temoin) Concentration Inhibition (mg/1) (%) comgee (%) PROBIT y log cone. x 10 7,5 7,5 3,520 1,000 15 63,5 63,5 5,330 1,176 20 61.0 61,0 5,250 1,301 25 77,2 77,2 5,740 - 1,398 30 99,7 99,7 7,330 1,477 #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! nb valeurs 5 Somme Moyenne 27,170 5,434 6,352 1,270 Probrt de la proportion inhibee en fonction du iogarithme decimal de la concentration a Valeurs experimentales Droite calculee 8,000 -!- 7,000 6,000 5,000 S 4,000 s 3,000 J- 2,000 0,000 0.200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 Logarithme decimal de la concentration 1,400 1,000 1,600 Company Sanitized. Does not contain TSCA CBi