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Sonderdruck aus ' Band 145, Heft 2 (1961) und Band 146, Heft 1 (1962) Archiv fr Hygiene und Bakteriologie VERLAG URBAN & SCHWARZENBERG, MNCHEN-BERLIN Alle Rechte, auch die des Nachdrucks, der photomechanischen Wiedergabe und der bersetzung Vorbehalten Aus der filtertechnischen Forschungsabteilung der Seitz-W erke GmbH (Leiter: Dr. H. Wilke) und dem Medizinaluntersuchungsamt Trier (Leiter: Med.-Rat Dr. Albrecht) 6 Adsorptionsfiltration von Viren mit Seitz-Entkeimungsfiltern 1. T e i l Von-H. Wilke und J. Albrecht Mit L Abbildung Auf dem Gebiet der Virusfiltration sind in den letzten 30 Jahren viele interessant - Untersuchungen durchgefhrt und dabei wichtige Ergebnisse gewonnen worden In manchen Fllen zeigten sich jedoch gewisse W ider sprche, die vielleicht dadurch zu erklren sind, da bei der Auswertung der Versuche die Elem entarvorgnge in den benutzten Filter nicht immer gengend bercksichtigt wurden Die ,,Eiitration" * kleiner Partikel ist bei keinem der bekannten Filter medien ausschlielich eine Folge der Porengre. Selbst in den F ilter membranen welche die allgemeine Vorstellung von einer ,,Siebung" der Teilchen noch am ehesten verwirklichen, treten komplizierte Sorptions vorgnge auf, die in Verbindung mit den meist hinzutretenden Ver stopfungserscheinungen zu Fehlschlssen fhren knnen Membranfilter sind nur in makroskopischer Sicht zweidimensionale Siebe mit rein mechanischer Trennwirkung. Deshalb sollten Versuche ber die Gren bestimmung von Viren auch hier nur unter Bercksichtigung aller phy sikalisch-chemischen und kolloidchemischen Filtervorgnge ausgewertet werden. Noch kom plizierter wird die Beeinflussung des Filtervorganges bei starren Tiefenfiltern, die vorwiegend aus keramischem M aterial gefertigt werden. Hierzu rechnen Chamberlandkerzen (Porzellanmasse), Berkefeld- * In der lteren mikrobiologischen Literatur spielt der Begriff ,,filtrierbar* eine besondere Rolle zur Charakterisierung der Viren. Dieser Begriff sollte jedoch heute nur noch in der Bedeutung gebraucht werden, die in berein stimmung mit der allgemein gltigen Nomenklatur in Wissenschaft und Technik steh t3. Danach sind Partikel ,,filtrierbar", wenn sie in oder auf einem Filter medium abgeschieden werden Die Teilchen, die mit der flssigen oder gas frmigen Phase das Filter passieren, drfen demnach nicht als ,,filtrierbar" bezeichnet werden, wie dies gelegentlich noch geschieht. B 70243/1 2.0 5*2 2 H. W ilke und J. A lbrecht Alter (gefrittete Kieselgur) und Glasfritten (Schottfilter). Bei diesen Filter medien ist ebenfalls weniger die physikalisch bestimmte, mittlere Poren gre fr den Filtrationseffekt magebend als eine Reihe anderer fil trationsbeeinflussender Faktoren. Wegen der fr virologische Arbeiten meistens gewhlten geringen Porenweiten spielt dabei die nie vllig auszuschaltende Blockierung der Durchgnge durch Begleitstoffe und Verunreinigungen der Substrate sowie durch die Mikroorganismen selbst eine besondere Rolle. Besonders unbersichtlich scheinen jedoch die Verhltnisse bei der dritten Gruppe der Entkeimungsfilter, nmlich bei den Seitz-Filterschichten zu liegen. Hier handelt es sich um lockere Tiefenfilter mit nicht definierter Porenausbildung, bei denen von einer siebartigen Beeinflussung so kleiner Partikel wie Viren nicht gesprochen werden kann. Wie unten ausgefhrt, handelt es sich um teilweise adsorptiv wirkende Filter, die fr Arbeiten in der P raxis den Vorteil der geringen Neigung zur V er stopfung haben. Fr jedes dieser drei Filtermedien bestehen bestimmte Verwendungs mglichkeiten. Sollen durch Filtrationsversuche W erte fr Teilchengren und Teilchenzahlen bestimmt werden, so knnen dazu nur Membranfilter mit sorgfltig gestuften Porenradien herangezogen werden 4> 5> n . F r die Reindarstellung von Virussuspensionen sind neben Membranen auch ke ramische Filter verwendbar, wenn kleine Flssigkeitsmengen vorliegen. Fr Arbeiten mit greren Substratmengen kommen vorwiegend SeitzFilter in Frage. In jedem Fall mssen die Auswirkungen der in den Substraten vor handenen lslichen und unlslichen Begleitstoffe auf die Filtration einer sorgfltigen Prfung unterzogen werden, bevor ber die Brauchbarkeit eines Filterverfahrens fr einen bestimmten Zweck entschieden wird. In weitgehendem Mae erfllt die Arbeit von Uecker 16 ber Membranfilter in der Bakteriophagenfiltration diese Forderung. Aufbau und Wirkungsweise der Seitz-Filter. Seitz-Entkeimungsschichten sind 4 bis 6 mm dicke, porse Filterkartons, die aus einer Mischung von Zellulosefasern mit fein fibrilliertem Asbest bestehen. Diese bilden ein Gerst mit vorwiegend in einer Ebene aus gerichteten Fasern. Auf physikalischem Wege kann man aus Durchflu messungen einen fiktiven m ittleren Porendurchm esser bestimmen, der bei den EKS-Schichten zwischen 1,2 und 1,5 ju schwankt. Wenn auch nicht von definierten Poren gesprochen werden kann, so mu doch ein Kanalsystem mit mittleren Wandabstnden in der gemessenen Grenordnung vor liegen. Da die meisten Viren ein bis zwei Zehnerpotenzen kleiner sind und da es mglich ist, diese Partikel ohne Verstopfung des Filtermediums abzufangen, kann ein Siebvorgang zur Erklrung der Sorption in SeitzSchichten nicht herangezogen werden. Vielmehr ist anzunehmen, da im wesentlichen Adsorptionsvorgnge fr den Filtereffekt magebend sind 2' 8' 17. A dsorptionsfiltration von V iren m it Seitz-E ntkeim u ngsfiltern 3 Die Adsorptionsfhigkeit der Asbestfaserschichten ist fr Kolloide sowie fr klein- und gromolekulare Verbindungen nachgewiesen worden. Von praktischer Bedeutung ist das Adsorptionsvermgen der Seitz-Entkeimungsschichten fr die Entfernung von Pyrogenen aus wrigen Injek tio n s- und Infusionslsungen 19. Das Gefge einer Seitz-Entkeimungsschicht stellt einen Kapillarraum dar. In ihm w erden durch die Faseroberflchen, die das Kanalsystem begrenzen, adsorptive Bindungen bew irkt. Solche Bindungen, gleichgltig welcher Natur sie sind, knnen nur erfolgen, wenn die zu bindenden P artik e l in den B ereich des K ra fitraumes der Faseroberflchen gelangen, also praktisch damit in Berhrung kommen. Durch die groe Zahl der Umleitungen der Flssigkeitsfden werden im Fasergerst derartige Zu sammenste begnstigt. Sie werden um so hufiger auftreten, je dichter die Schichten gepackt sind. Deshalb adsorbieren E SK -II-Schichten meist besser als die durchlssigeren EK S-Schichten. Andererseits ist auf diese Weise die merkliche Verminderung der Abscheidung von Teilchen aus viskosen Dispersionsm edien zu erklren. Da die Bew eglichkeit der P a r tikel herabgesetzt ist, sind auch die Zahl der Zusammenste m it den Fasern und damit die Adsorption vermindert. Dank der Adsorptionswirkung der asbesthaltigen Filterschichten knnen also Viren mit diesen verhltnism ig grobporigen Filtern abgefangen werden. Das hat den Vorteil, da relativ groe Filtriergeschwindigkeiten im Vergleich zu Siebfiltern erreicht werden und gleichzeitig eine geringe Neigung zur Verstopfung den Filtrationsverlauf begnstigt. Ftertechnische Aufgaben und filtrationsbeeinflussende Faktoren Die Durchlssigkeit der Seitz-Filterschichten fr Mikroorganismen der Grenordnung unter 0,1 u wird in der L iteratu r unterschiedlich b e u rteilt -- 10' 17. Tatschlich ist es mglich, zu erreichen, a) da V iren in den Asbestfaserschichten zurckgehalten werden, so da man ein virusfreies bzw. virusarmes F iltrat erhlt; b) da V iren, nicht aber grere P artik el (z. B. Bakterien ) die Schichten passieren. Das Resultat ist eine bakterienfreie, virushaltige Suspension. Entsprechende Filteraufgaben, deren Effekte im Gegensatz zueinander stehen, werden heute von der Praxis gestellt. Die Aufgabe der Virus elim inierung ergibt sich zum Beispiel bei der Gewinnung von T rink wasser aus Oberflchenwssern, die in beachtlichem Ma durch menschen pathogene V iren kontam iniert sein knnen 7- ,2. Die Lsung dieser A uf gabe ist besonders schwierig, weil groe Mengenleistungen erforderlich sind. Auf der anderen Seite steht das -- etwa fr die Produktion von Virusim pfstoffen bedeutende -- Problem, reine Virussuspensionen mg lichst ohne T iterverlu st zu gewinnen, die frei von B akterien und G ew ebe resten sind. W hrend frhere Untersuchungen sich vornehmlich auf die F iltratio n kleiner Substratm engen (bis 100 ml) beschrnkten, ist den oben 4 H. W ilke und J. A lbrecht genannten Aufgaben die Forderung nach w esentlich greren F iltra t mengen gemeinsam. Hinweise zur Beeinflussung der Adsorption in den F iltern geben die allgemein gltigen Regeln, die in der Tabelle 1 auf die Verhltnisse der Seitz-Filtration bertragen wurden. Diese keineswegs vollstndige Auf stellung lt erkennen, wie gro die Anzahl der Param eter ist, die den Vorgang der Adsorptionsfiltration bestimmen knnen. Jede Adsorption fhrt frher oder spter zur E instellung eines Gleichgewichtes, das im wesentlichen durch die Konzentration des zu adsorbierenden Stoffes (Adsorptiv) und die Menge des Adsorbens bestim m t wird. Da das Adsorbens im vorliegenden F all die Filterschichten sind, ist es sinnvoll, alle V er suche auf die E inheit der Filterflche zu beziehen. Da fern er die meist unbekannte Konzentration des Adsorptivs zwangslufig m it der Flssig keitsmenge gekuppelt ist, dient die pro Flcheneinheit durchgesetzte Flssigkeitsm enge, die man als Filterbelastung bezeichnet, zur filter technischen Kennzeichnung des Adsorptionsvorganges, wenn ihr ent sprechende Durchbruchswerte zugeordnet werden. Zur Durchfhrung der frher erwhnten Aufgaben ist somit folgendes anzustreben: a) F r die Trinkw asserfiltration mu die ursprngliche Adsorptionskraft der Filterschichten mglichst lange erhalten bleiben. Das Adsorptions gleichgewicht soll erst nach groer Filterbelastung erreicht werden. b) F r die R eindarstellung von Virussuspensionen mu durch adsorptions verhindernde Zustze das Adsorptionsgleichgew icht so w eit wie mg lich an den Anfang des Filtrationsprozesses verschoben werden. Die Inaktivierung der Filterschichten sollte d erart erfolgen, da zwar noch alle Bakterien und Frem dstoffe zurckgehalten werden, Viren aber schon nach geringer Filterbelastung passieren. Praktische Erfahrungen hei der Gewinnung hakterienfreier Virussuspensionen mittels Seitz-Filtration Einer der ersten, die sich der Seitz-F ilter bedienten, um B akterien von V iren zu trennen, w ar Waldmann (zit. 8) bei der Gewinnung der M aul und Klauenseuche-(M KS-)Vakzine. Da das V erfahren auch heute noch praktisch unverndert gebt wird, sollen an seinem Beispiel die G rund lagen der Reindarstellung einer Virussuspension in grerem Mastab beschrieben werden. Der zentrifugierte vlrige Auszug eines aphths vernderten Zungenepithels (7,5 kg 1001) w ird zunchst durch S e itz -K l rsch ich te n ,.K 7'1 v o rfiltriert, um gro bund kolloiddisperse T r bungsstoffe zu entfernen . H ierbei ist der V iru sverlust nur gering, sofern die K 7-Schichten nicht berlastet und dabei verstopft w erden. M an filtrie rt d eshalb m eist nicht m eh r als 175 1/m- in der K l rstu fe . Nach ordnungsgem er V orklrung erfolgt die Filtration durch S e itz -E K S Schichten, deren N orm albelastung hierbei 127.51 pro m2 Filterflche betrgt. Auch nach dem Passieren der E K S-Sch ich ten sind in den m eisten Fraktionen des F iltrats die gleichen V iru stiter wie m der Ausgangssuspension festzustellen. A dsorption sfiltration von V iren m it S eitz-E n tkeim u n gsfiltern 5 T a b e l l e 1: Adsorptionsbeeinflussende F aktoren allgem ein. Faktoi en Scitz-E ntkeim ungsfilter F iltr a tio n se in flu A dsorptionsm aterial (A d sorb en s) Z ellstoff-A sb est in u n ter schiedlichem M ischungs v e rh ltn is A. abhngig von Schichten sorte: Je hher der A sbest gehalt, um so strker die A dsorption, die in der R eihenfolge EK-EKS-EKS-1 -EK S-II zunim m t. V erteilungszustand F a d en -K a p illa ila u m in A. um so grer, je dichter (spezifische Oberflche) 4--6 m m d ick er Schicht. die ,,Packung" der Fasein. tn a0c) Fiktiver m ittleiei Porendu rch m . d er E K S 1,2--1,5 ft. Innere Oberflche je m - 5 E K S -F ilte r fl c h e ca. 5000 m-, o M en g e des A d so rb en s E ei allen Seitz-EK -Schich- A. abhngig von Flchen ^ im V erhltnis zur te n ca. 1200 g/m - F ilte r - belastun g, d. i. 1 F l ssig - Flssigkeitsm enge flche keit/m 2 Filterfiche. V orbeladung des A dsorb en s B lockierung der A dsorp tionszentren durch Frem ds lo lfe V erstopfung der Schicht. Einflu der Vorfiltration des Substrates. K ontaktzeit A bhngig von Strm ungs geschw indigkeit. Bei EKSSchichten u. Filli eig es c h w m d ig k e it 350 l/m-'h ca. 60" V e r w e ilz e it E instellung des A .-G leich gew ichtes um so rascher, je niedriger F iltriergeschw in digkeit; dam it abhngig vom Druck. K onzenti ation M oleklgi oe, -?! LG T eilch en grd e <a G renzflachenladung M ol/l-Teilchenzahl/I T eilch en .> 1--2 /< w e rd en auf Filteroberflche ge sieb t, T eilch en zw . 0,1--1 ft knnen z. T. im F ilte ig efiige m echanisch u. T eil chen < o ,l/! nur afsorptiv gebunaen w eiden. Filterschichten in w ri gem M edium not m alt rw eise negativ geladen Je hher die K onzen tration, um so groer die adsorbierte M enge und um so rascher E instellung des A .-G leichgew ichtes Grere M olekle w erden im allgem ein en leichter ad sorbiert als kleine. Fr kolloiddisperse Partikel gelten A dsorptionsisother m en m cht imm er. Bessere A. von positiv ge ladenen Partikeln und M oleklen m it basischen G ruppen. pH-W ert G renzflchenaktive B egleit subs tanzen c o A lt des D ispersions m ittels G <- V iskositt pH-W ert bestim m t G renz flchen adung des F ilter m aterials und des Adsorptivs. Steigender pH bedeu tet steigende negative L adunt. Ladungsandei ungen bereits du ich m edi ige K onzen trationen, Um ladung zu positiven G renzflchen m glich. B eeinflussung des Schich tengefuges durch polare und apolare L sungsm ittel. Losungen m it H ydroxyl gruppen quellen C ellulose. Strm ungsgeschw indigkeit in Filterschichten um ge kehrt porport. der V iskosi tt. Fi eie W eglnge der Partikel (Brownsche Be wegung) um gekehrt pro port. der V iskositt. In saurem M edium im a ll gem einen besser Filtr. als im alkalischen. Je g i er D ifferenz der G renzflachen ladung zw . Filter u. T eil chen, um so grer A. G ienzflchenaktive Stoffe knnen A. verhindern und Adsorbate eluieren. In apolaren Lsungsm itteln haben EK S-Schichten nah e zu doppelt so groe P oien d u rc h m esse r a ls in H aO. Feindisperse Partikel lassen sich um so schw ieriger ab scheiden, je hher die V iskositt. Porenw andnahe Schichten stagnieren! 6 H. W ilk e und, J. A lbrech t Virugtiter des U nfiltrates M /ru s tite r d e s E K S -F iltrates nach ausreichender _ 106 V o rfi/tra tio n log bliche Moximalbelastung 1 0 s beider H erstellung /on M K S -V akzine , 1(f V e rla u f d e r Virussorption a______ eines ung e n g e n d v o rfi/tn e rte n S u b s tra te s 1 102 10 10 20 30 A0 50 ' 60 70 80 90 100 110 120 130 F i/terela stung /, 'm *2 F/Iterflache m l/ 10 cm 2 A bb. 1. V e r la u f der M K S-V irus-Filtration bei der V akzinher s te llu n g . Diese V erhltnisse sind durch die ausgezogene K urve in Abb. 1 w iedergegeben (nach A usfhrungen von U b e r t in i 154). D ie K u rv e zeigt, da die e rsten 3,5 bis 4 L iter, die einen m 2 einer Seitz-E K S-Sch ich t passieren, virusfrei sind und etw a nach D urchgang von 15 1 m 2 der ursprngliche V iru stite r von 106 erreich t wird. Entsprechend verhlt sich das Haem oglobin, das bei der E xtrak tio n des Z u ngenepithels in das S u b stra t gelangt. B is zu 3,5 1 m 2 l u ft ein farb lo ses F iltra t ab. M it steigendem V iru stiter nimm t auch die Rotfrbung des Filtrates bis zur A usgangskonzentration zu, so da m an den Farb sto ffd u rch b ru ch als In d ik ato r fr die Beendigung des D urchlaufes der virusfreien Fraktion benutzen kann. Der relativ geringe Virusverlust bei einw andfreiem Filtrationsverlauf beruht zweifellos auf dem G ehalt der Virussuspension an Proteinen und Mucinen. Die Abb. 1 gibt ferner ein Beispiel fr eine Filtrationsstrung bei der M K SVakzine-H erstellung wieder (gestrichelte Kurve). Hierbei w ar insgesam t we niger F iltra t gewonnen worden m it nur einem B ru chteil der V irusm enge, die norm alerw eise erreicht wurde. Aus einem unbekannten Grund hatte man auf eine einw andfreie Vorfiltration verzichtet Dadurch gelangten mit dem Virus kolloiddisperse Trubungsstoffe m die Entkeim ungsfilterschichten, was zunchst zu ein er v e rst rk te n So rp tion fh rte. Schon bev or der G leichgew ichtszustand erreicht wurde, war eine Verstopfung des Filtergefges eingetreten, erkenntlich durch M inderung der Filterleistu ng. D abei nahm die V iruskonzentration rasch ab. was im Zusamm enhang mit der reduzierten Filtriergeschw indigkeit nur durch eine w eitgehende Porenverengung zu e rk lren ist, so da rein m echanisch Viren nicht m ehr hindurchgelassen werden. Die Erfahrungen bei der Gewinnung der M KS-Vakzine lassen er kennen, da kleine F ilterbelastungen Anla zu Fehlschlssen ber die W irksamkeit der Filterschichten geben knnen. Zur Bewertung eines Filterverfahrens sollten berlastungsversuche mit mglichst groen Flssigkeitsdurchst^en pro Filterflcheneinheit durchgefhrt werden. F ern er ist es wuchtig, da die zu filtrierenden V irussubstrate durch V or filtration geklart werden. Auch bei der Poliom yelitis-Im pfstoffherstellung kommt den Filtrations prozessen eine groe Bedeutung fr die Gewinnung unschdlicher und hochw irksam er Vakzinen zu. A nstelle der ursprnglich von Salk b e nutzten G lasfrittenfilter finden heute hufig Asbestfaserschichten V ei- A dsorption sfiltration von V iren m it S eitz-E n tkeim u n gsfiltern 7 w end u ng9. Um einen Im p fstoff m it mglichst hohem A ntigengehalt zu gewinnen, hat es nicht an Versuchen gefehlt, die Virusverluste bei der Filtration herabzusetzen. Hierzu hat man sich verschiedener Methoden bedient, von denen folgende genannt sein sollen: a) W irksam e V orklrung durch wenig adsorbierende Spezialschichten. b) W ahl einer mglichst kleinen Filterflche. Lamy und M ita rb .0 geben eine Flchenbelastung von 1500 1/m2 als optim alian, was zw eifellos im Hinblick auf die Adsorptionsverluste gnstig gewhlt ist. c) Vorsplen der Filterschichten m it H artley-Bouillon. Die ,,In aktivie rung" von Filterm edien m it proteinhaltigen Lsungen ist aus den Arbeiten ber M em branfilter und Filterkerzen schon seit etwa 30 Jah ren b e k a n n t4' 6' 14. F r S e itz -F ilte r hat man diese M ethode in Form einer Vorbehandlung mit einer Bouillonart verwendet. d) Erhhung der Menge an Am inosuren im S u b s tr a t9. e) Zusatz grenzflchenaktiver S to ffe (z. B. Tw een 80). Die adsorptions vermindernde Wirkung grenzflchenaktiver Stoffe fr Seitz-Filter be schreiben erstm alig Lamy und M ita rb .9, die m it 0,006 /oiger Tw een-80Lsung Polioviren aus belasteten Schichten auch wieder eluiert haben. f) Verw endung calcium freier Filterschichten. Calcium ionen kommen in Spuren als V erunreinigung in den Schichten v o r 18. Ihre W irkung wird so erklrt, da C a " m it dem Phosphat des V irussubstrats zu C alcium phosphat reagiert, welchen ein groes Adsorptionsvermgen gegen ber Viren zugeschrieben wird. Versuche mit calcium frei gewaschenen Schichten haben im Falle der Polio-Im pfstoffherstellung diese An nahme nicht besttigen knnen. Die erwhnten filtrationsbeeinflussenden Faktoren wurden von uns bei der Filtration grerer Flssigkeitsm engen, in denen C oli-T3-Phagen sus pendiert waren, untersucht. Die Versuchsergebnisse werden in einer wei teren M itteilung verffentlicht werden. Z usam m enfassung Nach einer bersicht ber Aufbau und Funktion der Seitz-F ilter werden A ufgaben besprochen, die heute an die V irusfiltration gestellt werden. E in er seits sind Fl ssigkeiten durch Filtration von M ikroorganism en einschlielich der V iren zu befreien. A ndererseits w ird die Gew innung von Virussuspensionen mglichst ohne V irusverlust gefordert, wobei alle greren P artikel, vor allem B akterien , elim in iert sein sollen. Hufig w ird die rasche Filteru n g groer Flssigkeitsm engen verlangt. Das Studium der W irkungsw eise sowie praktische E rfa h ru n g en zeigen M glichk eiten auf, um die gen an n ten F o rd eru n g en zu e rf lle n . Sum m ary A fter a survey of the structure and function of Seitz filters, current problems arising in connection w ith virus filtration are discussed; In filtering liquids the purpose m ay either be the elim ination of all m icroorganism s, including viruses, or the rem oval of ju st the larger particles, especially bacteria, from a virus suspension w ithout loss of virus. Fu rtherm ore, there is frequ en tly the 8 H. Wilke und ]. Albrecht need for a means of rapid filtration of large quantities of liquid. On the basis of an investigation of filter function, as well as practical experience, possi bilities are pointed out how to m eet the above requirem ents. Rsum A prs un coup d 'oeil sur la co n stru ctio n et la fon ctio n du filtre S eitz on d iscu te des tches qui s 'im posent a u jo u rd 'hui en ce qui con cern e la filtratio n des virus. D 'un ct, il fa u t d b a rra sse r des liqu id es p ar filtra tio n des m icro organism es y com pris des virus. De l 'au tre ct, on v eu t o b ten ir des suspensions de virus si possible sans perte de virus, tandis que les particules plus grosses, surtout les bactries, doivent tre lim ines. Souvent, on dem ande le filtrage rapid e de grand es q u an tits de liquid es. L 'tude du fo n ctio n n em en t ainsi que les expriences pratiques m ontrent des possibilits de satisfaire ces demandes. Schrifttum 1 A lb r e c h t, J ., N aturw iss. 44 (1957): 90 -- 2 B e r n o u lli, R., Arch. V irusforsch. 2 (1943): 533 -- 3 D IN -N orm blatt 7051 -- 4 E ifo rd , W. J., B rit. J . E xper. Path. 10 (1929): 126 -- 5 d er s., in : D o e r r - H a lla u e r : H andbuch d er V iru sforschung. I. H lfte (1938), S. 126 -- 6 G r e e n , A. B. u. H. E a g le s , B rit. J . E x p e r. P a th . 12 (1931): 202 -- 7 K e lly , S., A cta Med. Scan d. 159 (1957): 63 -- 8 K n ll, H., Erg. Hyg. 24 (1941): 266 -- 9 L a m y , M., A. P r in z ie u. P . d e S o m e r , Leeu w enhoek 23 (1957): 266 -- 10 L ip p e lt , H. u. G. B r a n d , Dtsch. Med. W schr. 79 (1954): 165 -- 11 M a y er, K . H. u. H. B e u t e ls p a c h e r , K o llo id -Z sch r. 135 (1954): 10 -- 12 M eln ick , J . L ., A m er. J . Hyg. 45 (1947): 240 -- 13 O litsk y , P. K . u. L. B o e z , J . E x p e r. Med. 45 (1927): 685 -- 14 T a lle r m a n , K . H., B rit. J . E xp er. P a th . 10 (1929): 360 -- 15 U b e r n i, B ., O ff. In t. Epizooties I 35 (1951): 627 -- 16 U e c k e r , W., Zbl. B a k t. I. 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V ersuchsanordnung: Als Filter benutzten wir eine Apparatekombination in Edelstahlausfh rung, bestehend aus einem Druckbehlter (Seitz-Einschichtenfilter Gr. 22 mit 10 Liter Fassungsvermgen) und einem darunter mittels Schraubver schlu und Dichtung befestigten Laborfilter von 6 cm Durchmesser (siehe Vimsfiltration 9 Abb. 1). Das Laborfilter diente zur Aufnahme der Entkeimungsschicht, die eine Filterflche von 20 cm2 hatte. Mit dieser Apparatur wurden jeweils ohne Unterbrechung Filterbelastungen von 10 000 m l/20cm 2 ( = 5000 1/m2) erzielt. Im allgemeinen sind bei einer entkeimenden Filtration hhere Str mungsgeschwindigkeiten als 3 50 l/m2h nicht blich, die bei nicht verstopften Schichten etwa bei einem Druck von 0,5 at erreicht werden. Da unter dW en Verhltnissen die Filtration einer Menge von 10 Liter durch eine Filterflche von 20 cm 2 ca. 30 Stunden gedauert htte, haben wir die meisten unserer Versuche mit einem Druck von 2 at durchgefhrt, um zu Filtrationszeiten innerhalb von 6--8 Stunden zu kommen. Bei einigen Versuchen wurde der Einflu der vom Druck abhngigen Filtriergeschwindigkeit auf den Ab scheidungseffekt untersucht und dabei nennenswerte Differenzen der Ab scheidung bei 0,8 at und bei 2 at nicht gefunden (siehe Tab. 1). Es sei jedoch darauf hingewiesen, da fr praktische Arbeiten Strmungsgeschwindig keiten von mehr als 350 l/m 2h nicht empfohlen werden knnen. Alle Versuche wurden mit der Filterschich tensorte Seitz-EKS durchgefhrt, die von den drei Seitz-Entkeimungsschichten die grte Durchlssigkeit besitzt (7). Mit Hilfe der dich teren Schichten EKS-I und EKS-II lt sich zwar eine strkere Adsorption erzielen; da je doch unsere Versuche auf die Filtration groer Flssigkeitsmengen abgestellt waren, haben wir Schichten mit mglichst hoher Filterlei stung gewhlt. Fr die meisten Versuche wur den Schichten benutzt, die nebeneinander aus einer groen Flche herausgeschnitten waren, um auf diese Weise die Gleichmigkeit des Filtermaterials zu gewhrleisten. Als Virusmo dell dienten Coli-T3-Phagen, die nach Williams und Fraser (9) einen sechskantigen Kopf von ca. 50 mp Durchmesser und einen kurzen Stummelschwanz von 10 mp Lnge haben. Ihre Abb. 1. Seitz-Filterapparatur mit groem Aufguraum und kleiner Filterflche. Vermehrung erfolgte in blicher Weise in Bouillonkulturen der W irts-Coli- bakterien. Zur Trennung der Phagen von den Colibakterien bzw. den Bak terienzellresten wurde die Suspension durch groflchige Seitz-AS-Schichten geleitet. Es resultierte eine bakterienfreie phagenhaltige Bouillon, die fr die Filterversuche mit destilliertem W asser im Verhltnis 1 :1 0 0 0 verdnnt wurde. Diese Flssigkeit enthielt 1 0 5 bis 1 0 6 Phagen pro ml (siehe Tab. 1) und einen aus der Nhrbouillon stammenden Eiweigehalt von Ib is 2mg/o. D er Nachweis der Phagen erfolgte in derW eise, da die zu prfende Pha gensuspension je nach zu erwartender Phagenzahl unverdnnt blieb oder im Verhltnis 1:10, 1:100 usw. bis 1 :107 verdnnt wurde. Aus mindestens 3 10 H. W ilk e und ]. Albrecht V erdnnungsstufen wurden je 0,1 ml auf eine-N hragarplatte gegeben und auf deren Oberflche gleichmig verteilt, nachdem die Agaroberflche vor her mit den empfindlichen Colibakterien beimpft worden war. Nach 24stndiger Bebrtung wurden die im Colibakterienrasen entstandenen ,,Pla ques" gezhlt. Als sogenannte Grolochphagen bilden T -Phagen Plaques von solcher G estalt, da eine Zhlung leicht mglich ist (siehe Abb. 2). In der A nnahm e, da ein ,,Plaque" im Bakterienrasen durch einen Phag her vorgerufen ist, wurde durch Auszhlen der Phagenlcher auf den Agarplat ten, die mit der Phagensuspension in verschiedener Verdnnung beim pft war, die Anzahl der in der Suspension vorhandenen Phagen berechnet. Entsprechend der Verwendung von maximal 0,1 ml der zu prfenden Suspension lag die N achweisbarkeitsgrenze bei 10 Phagen pro ml. In Vorversuchen haben wir die Streubreite unserer Zhlmethode erm it telt. Bei mehrmaligen, gleichzeitigen Bestimmungen des Phagengehaltes der gleichen Suspension nach der beschriebenen W eise ergaben sich Streuungen um den M ittelw ert (doppelte Standardabweichung) zwischen 50 und 60%). Die Zahl der Phagen im U nfiltrat wurde bestim m t durch Zhlung sowohl vor Beginn als auch nach Beendigung eines jeden Versuches, in letzterem Fall im Rest der im D ruckbehlter zurckgebliebenen Flssigkeit. Je nach Durchlaufgeschwindigkeit lagen zwischen den beiden Bestimmungen Zeiten zwischen 2 V2 und Stunden. Eine nderung des Phagengehaltes, insbe sondere eine Abnahme durch den A ufenthalt im D ruckbehlter, wurde nicht beobachtet; D ifferenzen der M ewerte lagen innerhalb der Streubreite der Methode. Das M ittel aus den beiden W erten ergab die Zahl der Phagen im Unfiltrat. D ie Bestimmung der Phagenzahl im Filtrat erfolgte jew eils in dem ersten M illiliter der durch das Filter gelangenden Flssigkeit sowie nach Filtration bestimmter Mengen Phagensuspension. V irusfiltration 11 V ersu chsergebn isse a) Filtration groer M engen eiweiarmer Flssigkeit 8--10 Liter der 1 :1 0 0 0 verdnnten Phagenbouillon (pH 6,8, Eiweigehalt ca 2 mg/o) wurden in mehreren Versuchen durch 20 cm2 Seitz-EKS-Schicht filtriert. D ie Ergebnisse sind in Tab. 1 aufgezeichnet, wobei die angegebene M enge filtrierte Flssigkeit auf einen Q uadratm eter Filterflche bezogen ist. Die mittlere prozentuale Durchlssigkeit ist aus Tab. 3 ,1 . Spalte und Abb. 3 und 4, Kurve A ersichtlich. D er erste Phagendurchbruch erfolgt bei einer Belastung zwischen 1500 und 2000 l/m2 Filterflche. M it steigender Filter belastung nimmt der Phagendurchgang relativ langsam zu; nach Durchgang von 5000 l/m 2 Filterflche waren im Filtrat in der Grenordnung 10%> der im U nfiltrat erm ittelten Phagenzahl nachzuweisen. Eine Steigerung des Fil trationsdruckes von 0,8 auf 2 at ergab keine nderung der Durchla quoten. Die Durchlaufzeiten waren druckabhngig; sie betrugen im M ittel bei einer Filterbelastung von 3000 l/m 2 2 Vs h (0,8 at) bzw. 1 h 25 min (2 at), bei einer Filterbelastung von 5000 l/m 2 und einem Filtrationsdruck von 2 at 2 h 36 min. M it den Versuchen Nr. 9--11 sollte nachgeprft werden, ob im Filter vor handene Kalziumionen einen Einflu auf die Phagenfiltration ausben. Die Seitz-Entkeim ungsschichten enthalten pro m2 etwa 0,4--1,0 g Kalzium, das bei der Herstellung nicht restlos aus Zellstoffen und Asbest entfernt werden kann. Um die Schichten kalziumfrei zu machen (7), wurden sie angefeuchtet, 5 min. lang mit n/5 0 Salzsure durchtrnkt und anschlieend mit 500 ml dest. W asser nachgewaschen. W ie die in Tab. 1 auf gezeichneten W erte zei gen, verhielten sich die kalzium freien Schichten im Hinblick auf den Phagen durchla ebenso wie die unbehandelten Schichten. b) Filtration eiweiarmer Phagensuspensionen durch peptonvorbehandelte Schichten. In den folgenden Versuchen (Nr. 12--21) wurden die Seitz-EKS-Schichten vor der Phagenfiltration mit peptonhaltigen Flssigkeiten vorgesplt. Zu diesem Zweck haben wir unter einem Druck von 2 at in steigenden M en gen (100 bis 500 m l/20 cm2 = 50 bis 250 l/m 2) 0,1 bzw. 0 ,2 % ig e wrige vorfiltrierte Peptonlsung (pH zwischen 7,0 und 7,2, Pepton der Fa. W itte) und unm ittelbar anschlieend, ohne Nachsplung, bis zu 5000 l/m 2 Filter flche 1 :1 0 0 0 verdnnte Phagenbouillon durch die Schichten filtriert. Die Ergebnisse sind in Tab. 2 aufgezeichnet, wobei der Phagendurchbruch in / der Phagen vor dem Filter angegeben ist. Die Resultate der Versuche Nr. 14 und 15 sowie 20 und 21 sind in Abb. 3 graphisch dargestellt (Kurven B--E). Nach V orbehandlung mit 50 1 Peptonlsung pro m2 Filterflche unter scheiden sich die M ew erte (Phagendurchbruch, Durchlaufzeiten) nicht we sentlich von denen, die ohne Vorbehandlung der Schichten erm ittelt wurden (Tab. 3, 1. Spalte). M it zunehmender Intensitt der Peptonvorsplung sind Tabelle 1 Ergebnis der Seitz-Filtration phagenhaltiger, eiweiarmer Flssigkeit . Wilke und ]. Albrecht Vers.- Druck Nr. at Suspensions Vorbehandlung medium der Schichten Unfiltrat 0,5 1:1000 1 0,8 verd. Bouillon ohne 820 000 0 2 0,8 ohne 707 500 0 3 0,8 4 0,8 5 0,8 6 2,0 ,, ,, ,, ohne ohne ohne ohne 855 000 1 490 000 1 110 000 939 000 0 0 0 0 7 2,0 n ohne 587 500 0 8 2,0 9 2,0 ohne HCl gewaschen, Aquadest. nachgesplt 861 000 236 000 0 0 10 2,0 11 2,0 ,, 367 000 0 ,, 146 500 0 A n z a h l P h a g e n p r o ml Filterbelastung (1/m2 Filterflche = ml/cm2) 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 0 0 -- 0 -- 300 X 0 0- 10 - 1010 - 7 900 X 0 0 - 220 1450 6480 - 28 000 X 0 0- 0 80 810 - 8 640 X 0 0 - 0 0 0 0 160 X 0 0- 30 - 70 - 640 - 3150 0 0 - 60 - 4470 - 24 970 - 81500 0 0 - 0 - 190 3150 - 15 350 0 0 0 125 -- 1850 -- 7150 -- 13 550 0 0 20 610 - 585 - 4 300 - 151000 0 0 0 120 - 1733 - 3 050 - 28 430 Zeichenerklr ung: 0 = < 10 Phagen/ml -- = nicht gemessen X ~ Versuch beendet V irusfiltration 13 A Filter ohne Vorbehandlung B Vorsplung mit 100 1 0,l/oigem Pepton/m2 C Vorsplung mit 250 1 0,l% igem Pepton/m2 D Vorsplung mit 100 1 0,2/oigem Pepton/m2 E Vorsplung mit 250 1 0,2n/oigem Pepton/m2 Abb. 3. Einflu der Vorbehandlung der Seitz-Entkeimungsschichten mit Peptonlsungen auf die Phagenabscheidung. ein verstrkter Phagendurchbruch und verlngerte Durchlaufzeiten zu ver zeichnen.Die Vorbehandlung mit 250 1 einer 0/2% igen Peptonlsung pro m2 Filterflche hatte zur Folge, da bereits in den ersten Tropfen des Filtrats Phagen nachzuweisen waren, deren Anzahl nach einem Durchsatz von 250 1/m2 auf 1 % der Phagen im Unfiltrat anstieg. Aus zeitlichen Grnden wurden die Versuche mit Vorsplung von 200 1 bzw. 250 1 0 ,2 % Pepton pro m2 Filterflche nach 6 h 20 min. (Filterbelastung 4000 1/m2) bzw. 6 h (Filterbelastung 2500 1/m2) abgebrochen. c) Filtration eiweihaltiger und viskoser Phagensuspensionen. Der 1 :1000 verdnnten Phagenbouillon wurden verschiedene Substanzen in folgenden Mengen zugesetzt: 0,1 bzw. 0 ,2 % Pepton (Fa. W itte), 0 ,2 % Laktalbumin (Fa. Difco) und 0 ,0 1 % Agar-Agar (Fa. Difco). Das pH der Eiweilsungen lag bei 7,0, das pH der A gar-A gar-Lsung bei 7,5. Diese Flssigkeiten haben wir in gleicher W eise wie vorher beschrieben bei einem Druck von 2 at durch Seitz-EKS-Schichten filtriert. In den Spalten 2--5 der Tab. 3 ist die mittlere prozentuale Phagendurchlssigkeit von je 4 Versuchen (mit A gar 3 Versuche) aufgezeichnet; in Abb. 4 sind die W erte graphisch aufgetragen und mit der Kurve des Phagendurchbruches bei Verwendung der 1 :1 0 0 0 verdnnten Bouillon ohne Zustze verglichen. W hrend bei Fil tration der 1 :1 0 0 0 verdnnten Bouillon der Phagendurchbruch relativ spt begann und dann nur langsam zunahm (Kurve A ), wurde nach Zusatz von 0 ,2 % Laktalbumin zum Dispersionsmittel das Adsorptionsvermgen der Filterschichten schnell herabgesetzt (Kurve D). Nach einer Filterbelastung von 500 1/m2 war ein Durchbruch von ca. 1 0 % zu verzeichnen, der in dieser Grenordnung bei Belastung bis zu 5000 1/m2 erhalten blieb. Das Mittel der Durchlaufzeit fr 5000 1/m2 war von 2 V2 h auf 3 h leicht erhht. 14 H. W ilk e und J. A lbrecht A 1:1000 verdnnte Bouillon ohne Zustze B 1:1000 verdnnte Bouillon + 0,1%> Pepton C 1:1000 verdnnte Bouillon + 0,2% Pepton D 1:1000 verdnnte Bouillon + 0,2% Laktalbumin E 1:1000 verdnnte Bouillon + 0,01% Agar-Agar Abb. 4. Einflu proteinhaltiger und viskoser Dispersionsmedien auf die Phagenab scheidung in Seitz-Entkeimungsschichten. Auch whrend der Filterung der peptonhaltigen Lsungen war ein rela tiv frh einsetzender und rasch zunehmender Phagendurchbruch zu beob achten (Kurven B und C). Mit steigender Filterbelastung nahmen die Durch laufzeiten deutlich zu, so da die Versuche nach etwa 6 Stunden bei 1750 1/m2 (0 ,1 % Pepton) bzw. 1000 1/m2 (0,2/o Pepton) abgebrochen wur den. Es ist zu vermuten, da der Durchsatz der Lsungen durch eine einset zende Verstopfung der Filterschichten erschwert war. Hinsichtlich der Aufhebung der Phagenadsorption am wirksamsten er wies sich die 0,01/oige A gar-A gar-Lsung (Kurve E). Bereits nach einem Durchsatz von 100 1/m2 waren im Filtrat 6 0 % der im Unfiltrat vorhandenen Phagen nachzuweisen. Mit steigender Filterbelastung nahm die Phagenzahl im Filtrat ab, gleichzeitig war die Durchlaufzeit stark verlngert. Dies lt auf eine zunehmend strker werdende Verstopfung des Filtergefges mit mechanischer Retention der Phagen schlieen. Diskussion der Versuchsergebnisse Bei einer Errterung der Filtrationsmechanismen in Zellulose-Asbestfaser-Schichten ist zu bercksichtigen, da viele Faktoren auf den Filtra tionsvorgang einzuwirken vermgen. Da fr den Filtereffekt im wesent lichen Adsorptionsvorgnge magebend sind (8), sollten sich Untersuchun gen hierber nicht nur auf Einflsse des Filters selbst (z. B. Porenweite) oder der zu filternden Teilchen (z. B. Teilchengre), sondern vor allem auch auf den Einflu des Mediums erstrecken, das als Dispersionsmittel fr die zu filternden Teilchen dient. Unterschiedliche Zusammensetzungen der Ad sorptionsmedien fhren innerhalb des adsorbierenden Systems zu kolloid- Virusfiltration Tabelle 2 Phagendurchbruch nach Vorbehandlung der Seitz-Filterschichten mit eiweihaltigen Lsungen Versuch- SuspensionsNr. medium 12 1:1000 Bouillon 13 1:1000 Bouillon 14 1:1000 Douuion 15 1:1000 Bouillon 16 1:1000 Bouillon 17 1:1000 Bouillon 18 1:1000 Bouillon 19 1:1000 Bouillon 20 1:1000 Bouillon 21 1:1000 Bouillon Vorbehandlung der Schichten pro m2 Filterflche 50 1 0,1% Pepton 50 1 0,2% Pepton 100 1 u ,i"/o Pepton 100 1 0,2% Pepton 150 1 0,1% Pepton 150 1 0,2% Pepton 200 1 0,1% Pepton 200 1 0,2% Pepton 250 1 0,1% Pepton 250 1 0,2% Pepton 0,5 0 0 (f) 0 0 0 0 0 0 0,005 P h a g e n d u r c h b r u c h i n #/o bei Filterbelastung (1/m2 Filterflche = ml/10 cm2) 250 500 1000 2000 2500 3000 4000 --0 0 0,02 - 0,15 1,23 5000 1,5 --0 0 0 0,006 - r h 0 47 - 0,28 1J L j'J .in' 0,82 "> 4,41 KQJ , 1. - 0,05 0,72 3,72 - 11,8 17,5 18,2 0,09 0,34 4,05 - 45,0 39,0 43,4 0,34 0,28 2,36 9,2 - 7,2 11,8 19,3 0,044 0,25 1,7 17,3 12,9 83,6 1,23 0,99 3,4 5,1 - 16,4 17,3 X ~ 0,035 0,046 1,9 1,5 2,7 4,5 3,8 - 4,7 22,1 X 8,4 26,0 Zeichenerklrung: siehe Tabelle 1 Tabelle 3 Phagendurchbruch bei Seitzfiltration eiweihaltiger und viskoser Medien Suspensions medium Mittel aus Ver suchen 0,5 P h a g e n d u r c h b r u c h in % bei Filterbelastung (1im Filterflche ~ ml/lO cm2) 100 200 250 300 400 500 600 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 5000 1 :1000 Bouillon 11 c --- ' 0,0008 - 0,02 0,07 0,2 - 1,3 9,0 1 :1000 Bouillon + 0 ,1 % Pepton 4 C - - 0,2 - - 3,2 - 18,1 44,3 44,0 84,0 23,5 X 1 :1000 Bouillon 0 ,2 % Pepton 4 0,0004 - - 2,0 - - 21,7 - 53,0 100 X 1 :1000 Bouillon + 0 ,2 % Lactalbum in 4 1 :1000 Bouillon + 0 ,0 1 % Agar Agar 3 ; --- - - 8,9 - - 16,3 - c 59,5 44,7 - 31,5 44,7 6,3 0,8 X - - 21,2 - 27,0 - 35,5 56,0 Zeichenerklrung: siehe Tabelle 1 V irusfiltration 17 chemischen Vernderungen, die sowohl die Teilchen als auch die innere Oberflche der Filterschicht betreffen. Bei den vorliegenden Versuchen blieben von den Adsorptionspartnern Adsorbens und Adsorptiv weitgehend konstant, whrend die Zusammen setzung des Adsorptionsmediums Vernderungen erfuhr. Fr Partikel in der A rt und Gre der Coli-T3-Phagen zeigten die SeitzEntkeimungsschichten ein starkes Adsorptionsvermgen, wenn wrige Medien ohne Zustze als Dispensionsflssigkeit dienten und die Schichten nicht vorbehandelt waren. Aus technischen Grnden war es nicht mglich, eine vllig eiweifreie Phagensuspension herzustellen. Abgesehen von den Phagen selber enthielt die 1 :1 0 0 0 verdnnte Bouillon ca. 2 mg/o Eiwei substanzen. Im Verlauf der steigenden Filterbelastung wurden diese und evtl, andere, im vorfiltrierten Dispensionsmittel in geringer Menge gelste Substanzen im Filter angereichert, wodurch die langsame Abnahme der Ad sorptionsfhigkeit der Schichten und der Filtrier-Geschwindigkeit erklrt werden kann. Eine Vor Splung der Schichten mit Peptonlsungen bewirkte eine deut liche Verminderung der Adsorptionskraft des Filters. Je mehr Pepton zur Vorbehandlung verwendet wurde, um so strker war der beobachtete Pha gendurchbruch. In hnlicher Weise war eine rasche Abnahme der Adsorp tionsfhigkeit der Filter fr Phagen zu verzeichnen, wenn die Eiweisub stanzen dem Dispersionsmedium zugesetzt waren. Im Vergleich zu den Kur ven, die nach Filtervorbehandlung erzielt wurden, waren die Durchbruchs kurven jetzt steiler; schon bei geringer Filterbelastung erfolgte der Phagen durchbruch in verstrktem Mae. Bei Filterung der in den Peptonlsungen suspendierten Phagen zeigte sich ferner eine Abnahme der Filtriergeschwin digkeit ( = Zunahme der Durchlaufzeit), wodurch nach Erreichen eines ma ximalen Phagendurchbruchs der Filtrationsvorgang schlielich sistierte. Die ses Ereignis wird auf eine zunehmende Verstopfung des Filtergefges zu rckgefhrt; es fand sich in weit geringerem M a, wenn statt des Peptons Lactalbumin als Zusatz zur Filterflssigkeit gewhlt wurde (siehe Abb. 4, Kurven B und D). Um nhere Aufschlsse ber die N atur der Vorgnge im Filtergefge bei Anwesenheit von Proteinen zu erhalten, haben wir an EKS-Filterschichten dynamische Adsorptions- und Desorptionsmessungen fr 0,1 und 0 ,2 % Pepton und 0,1 und 1 % Serumeiweilsungen durchgefhrt. Abhngig von der Menge der filtrierten Flssigkeit und der Eiweikonzentration resultie ren Sorptionskurven, von denen in Abb. 5 diejenige fr 500 1/m2 Splung mit 0 ,2 % Pepton wiedergegeben ist. Es wurde gefunden, da beim Durch splen einer 0,l% ig en Peptonlsung mit einer Filtriergeschwindigkeit von 10 0 0 --2000 1/m2 h bis zu 14,3 g Pepton pro m 2 Filterflche, aus einer 0,2/oigen Peptonlsung bis zu 24,2 g Pepton pro m 2 Filterflche von den Schichten sorbiert wurden. Das Adsorptionsgleichgewicht trat bei 0 ,l% ig e r Peptonlsung nach etwa 350 1/m2, bei 0,2% ig er Peptonlsung nach etwa 200 1/m2 ein. Durch Auswaschen mit destilliertem W asser konnte der grte 18 H. W ilk e und ]. Albrecht Teil des Adsorptivs wieder eluiert werden. Schon nach Durchgang von 50 1/m2 waren 70--8 0 % der desorbierbaren M enge herausgelst. Nach 200 1/m2 lie sich im W aschw asser Pepton nicht mehr nachweisen, gleichgltig wie hoch die Eiweibelegung ursprnglich war. W ir stellten aber fest, da eine nicht auswaschbare Resteiweimenge an den Fasern der Schichten gebunden blieb. Auch nach Auswaschen mit 1000 1 W asser pro m2 Filterflche konnte mittels der Murexidprobe noch Eiwei in den Schichten nachgewiesen wer den. Die fixierte Restm enge lt sich aus den Adsorptions- und D esorptions kurven fr die mit 0 ,2 % Pepton gesplten Filter zu 6,2 g/m 2 und fr die mit 0,l/o Pepton gesplten Schichten zu 3,05 g/m2 errechnen. Aus den Ergebnissen unserer Versuche schlieen wir, da der Durchbruch von Phagen bei Gegenwart von Eiwei- Substanzen in Seitz-Filterschichten vorwiegend Folge einer Adsorptionsverdrngung ist. Durch Adsorption der Eiweimolekle, die etwa um den Faktor 100 kleiner sind als die Phagen, werden die A dsorptionszentren im Z ellstoff-A sb estfaser-Sy stem mit einer fest-haftenden Eiweischicht belegt, so da ihre Fhigkeit zur adsorptiven Bindung von Phagenpartikeln teilweise oder ganz verloren geht. Inwieweit bei diesem Vorgang weitere filtrationsbeeinflussende Faktoren eine Rolle spielen, ist noch nicht bekannt. Es ist mglich, da auch eine Schutzkolloid wirkung der Eiw ei-Stoffe, nderungen der elektrischen Ladungsverhlt nisse an den Grenzfllen sowie eine Steigerung der Viskositt des Suspen sionsmediums das Adsorptionsverm gen der Schichten herabsetzen. Diese Vermutung wird durch die Feststellung verschiedener Untersucher gesttzt, wonach neben Eiw eisubstanzen (z. B. Serumeiwei [1 ,6 ], Bouilloneiwei [1, 3], G elatine [5]) auch Polysaccharide (z. B. A lginate [2]) und oberfl chenaktive Substanzen (z. B. Tw een 80 [4]) die A dsorptionsfhigkeit der Seitz-Filterschichten fr Viruspartikel verringern. Unsere Versuche mit Agar-Agar-Lsungen haben gezeigt, da Polysaccharide in besonderem M a zu Filtrationsanom alien neigen. W ir konnten einen starken Phagen durchbruch bei geringer Filterbelastung sowie gleichzeitig eine deutliche Reduzierung der Filtratleistung -- wahrscheinlich infolge rasch zunehmen der Verstopfung des Porengefges -- beobachten (siehe Abb. 4, Kurve E). W eitere Untersuchungen, besonders mit geringeren Agar-Konzentrationen, .verden Aufschlu darber geben, inwieweit diese Vorgnge auf eine aus nehmend starke Blockierung der A dsorptionszentren, auf die deutlich er hhte Viskositt (0 ,0 1 % Agarlsung 1,7 cP) oder auf andere, frher (8) genannte filtrationsbeeinflussende Faktoren zurckzufhren sind. Von der Praxis werden der Virusfiltrationstechnik heute hauptschlich 2 ver schiedene A ufgaben gestellt, deren Ziele im Gegensatz zueinander stehen; nmlich: a) Herstellung virusfreier bzw. virusarmer Filtrate, etwa zur Gewinnung von Trinkwasser aus Oberflchenwssern, wobei groe Mengenleistungen erforderlich sind, b) Gewinnung von Virussuspensionen mglichst ohne Virusverlust, die frei Virusfiltration 19 Abb. 5. Adsorption und De sorption von Pepton an SeitzEKS-Schichten, Pepton im U nfiitrat 2,0 \ V 'A dsorption aus 0,2% f 'epfon Spimenge 500 i/m 1 eptonlosung Fi/tert eistung 1200...210t>i/m 2h isto adsorbierte Menge 24.2 g/m2 desor Vierte Menge 18.0 g /m 2 I nichtt 'esorbierbar 6.2 g /m 2 Desorption md dest. Wiisser 100 200 300 400 500 Fi/terbeiastungin i/m 2Filterflche=m1/10 cm 2 von Bakterien, Gewebsresten und anderen korpuskularen Bestandteilen sind, zu. B. bei der Herstellung von Virusimpfstoffen. Auf Grund der in der Literatur wiedergegebenen und unserer eigenen Erfah rungen empfehlen wir, bei der Verwendung von Seitz-EKS-Schichten fr diese Aufgaben folgende Regeln zu beachten: zu a) Zur Herstellung eines virusfreien Filtrats sollten kleine Flssigkeits mengen durch groe Filterflchen filtriert werden. Das Suspensionsmedium darf nur geringe Mengen an hochmolekularen Stoffen (besonders Pro teine und Polysaccharide) und an oberflchenaktiven Substanzen enthalten. Die Entkeimungsschichten sind nicht mit trbstoffreichen Flssigkeiten zu belasten, was durch ausreichende Vorfiltration erreicht werden kann. zu b) Bei der Gewinnung bakterienfreier Suspensionen mit mglichst ho hem Virusgehalt sollten kleine Filterflchen fr groe Flssigkeitsmengen Verwendung finden. Die Viruskonzentration vor dem Filter ist mglichst hoch zu whlen. Das Suspensionsmedium sollte hochmolekulare Substan zen enthalten, die eine Adsorptionsverdrngung der Viren bewirken, oder die Filterschichten sollten mit solchen Substanzen vorgesplt werden. Hier bei wird man insbesondere bei der Vakzineherstellung den Polysacchariden vor den Eiweistoffen wegen der antigenen Wirksamkeit der letzteren meist den Vorzug geben. W ir weisen darauf hin, da diese Filtrationsregeln keine Gesetzmig keiten darstellen. Die komplizierten Vorgnge bei der Adsorptionsfiltration sind noch zu wenig untersucht worden, als da man bereits Gesetze auf stellen knnte, die eine Vorausberechnung der Filtrationsvorgnge gestat ten. Zusammenfassung Mit Coli-T 3-Phagen als Virusmodell wurden Filtrationsversuche bei Belastun gen von Seitz-Entkeimungs-Schichten bis zu 5000 l/m2 durchgefhrt. Das Suspen sionsmedium fr die Phagen war teils begleitstoffarm, teils waren ihm Pepton, Lactalbumin oder Agar-Agar zugesetzt, oder die Schichten waren mit Pepton vor gesplt. Das gute Adsorptionsvermgen der Zellstoff-Asbestfaser-Schichten fr Phagen in begleitstoffarmen Medien war durch Proteine und Polysaccharide deut lich herabgesetzt. Die Ursachen hierfr werden diskutiert. Regeln zur Durchfh rung der von der Praxis gestellfen Virusfiltrationsaufgaben werden aufgestellt. 2 0 H. Wilke und J. Albrecht Summary Filtration experiments with Seitz bacterial filters at stresses up to 5000 1/m2 were conducted with coli phage Ts as a virus model. The medium in which the phages were suspended contained partly only low concentrations of foreign material, partly peptone, lactalbumine or agar-agar were added, or the layers were pre-rinsed with peptone. The good adsorptive capacity of the celluloseasbestos layers for phages suspended in media poor in foreign material is clearly decreased by proteins and polysaccharides. The causes for this phenomenon are discussed and rules set up for handling problems of virus filtration. Rsum On procde des essais de filtrage avec des T3-coli-phages comme type de virus et avec des couches de strilisation Seitz charges jusqu' 5000 1/m2. Le milieu de suspension des coli-phages tait tantt sans addition, tantt avec addi tion de peptones, de lactoalbumine ou d'agar-agar, ou bien on avait rinc les couches de strilisation aux peptones. La haute puissance d'adsorption des couches de cellulose et de fibres d amiante pour coli-phages en milieu sans addition tait fortement diminue par les protines et les poly- saccharides. On discute les causes de ce phnomne. On fixe des rgles pour les filtrages de virus qui sont ncessaires dans la pratique. Schrifttum fr Teil 2 (Schrifttum fr Teil 1 siehe Seite 8) 1 Albrecht, J., Naturwiss. 44 (1957) . 9 0 -- 2 Hyslop, N. S. G., Nature 191 (1961) : 305 -- 3 Kanarek, A. D., A. P. Goffe u. A. } Woidwood: zit. 5 -- 4 Lamy, M., A. Prinzie u. P. de Somer, Leeuwenhoek 23 (1957) : 266 -- 5 Mares, J., M, Drevo u, D. 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