Document Rv78kE3kYj4qOxnmdVMvL96X
Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.:
ELF ATOCHEM
15-Mar-95 258250
AR226-3011
Bacteria Growth Inhibition Author(s): H. Thiebaud
Coll. A.M. Petit
English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions Enterprise 27-Jan-03
Company Sanitizs:1. Doea noS contain TSCA CB!
ELF ATOCHEM Levallois Applications Center
TECHNICAL SUMMARY
b^^HUU^jwas Determination of growth inhibition of Pseudomonas putida bacteria
effected
using the operating procedure described in proposed standard ISO/DIS T0712 (cf. doc 11i?wnorT90B).
The method consists in exposfng the bacteria for 16 hours to a range of concentrations of the substance being studied. The inhibiting effect observed on Pseudomonas putida is determined by comparing the
cell growth at various dilutions of the substance with the cell growth obtained for a culture under the same conditions but which does not contain the test substance. The cell growth is determined by turbidimetry
using a spectrophotometer.
The percent cell growth inhibition H is given by the relation :
H = ((Bk - Bn)/(Bk - B0))x100
where Bk and Bn are the turbidities, respectively, in the control and test flasks (after deduction of noninoculated whites) and BO is the turbidity at t = 0 in the control flasks.
Under the test conditions1BUB|R)resents a :
CEso -16 h = 28 mg/l, with a confidence interval at 95 % = 16 - 41 mg/l
and a
CEio -16 h = 1.2 mg/l, with a confidence interval at 95 % = 0.12 - 3.6 mg/l
The reference substance, 3,5-dichlorophenol, has a CEao -16 h equal to 17 mg/l and a CEio -16 h equal
to 9.1 mg/l
The validity criteria mentioning that the inoculum used in the control grew by at least a factor of 60X for the duration of the test was respected (growth factor = 104).
A. M. PETIT
H. THIEBAUD
. no-a^eo"131"1'
Co^anySan^.Do-
ELF ATOCHEM
D.C.R.D. Centre d'Application de Levallois Service Analyse Environnement
Levallois Ie: 15/03/95 Ref. document: 258250 NdeSequentiel:814020
TITRE :
DETERMINATION DE [.'INHIBITION DE LA CROISSANCE DES BACTERIES PSEUDOMONAS PUTIDA
AUTEUR(S): H.THIEBAUD Coll. A.M. PETIT
RESUME DOCUMENTAIRE :
l^lj----------UB^n Determination de rinhtbition de la croissance des bacteries Pseudomonas putida
par
suivant Ie mode operatoire decrit dans la methods du
projetaenomielSO/DIS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B).
|;|nhibition de la croissance des bacteries Pseudomonas putida; TSO/DIS 10712
DESTINATAIRE : M. DEVAUX (DCFS)
Ce rapport cornprend 3 pages et N feuillets non pagines (feuilles de saisie, de calcul et representation graphique)
Copies :
Chef de Service, Responsable des Archives,
Laboratoire d'ecotoxicologie (copie coll.)
Secretariat, Fichier TECH
Service Ecotoxicite et Surete des Produits (DSEP)
,;
Ce document est la proprtete d'ELF ATOCHEM. II ne peut 6tre ni copte, ni communique a des tiers sans autorisatton formelle.
C o ^ ^ 5 ^ ' " La reproduction de ce rapport d'etude n'est autorisee que sous forme de fac-simil6 photographique integral.
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REPS3890.DOC Page 1/3
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ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levallois
RESUME TECHNIQUE
\^imfW^ La deterTninatioi^j^.j^
de la croissance des bacteries Pseudomonas putida
par
ete realisee en suivant Ie mode operatoire decrit dans Ie
projet de norrne ISO/DIST10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B).
La methode consiste a exposer pendant 16 heures les bacteries a une gamme de concentrations de la substance etudiee. L'effet inhibiteur sur Pseudomonas putida est determine par comparaison de la croissance cellulaire des diverses dilutions de substance avec la croissance cellulaire obtenue pour une culture realisee dans les memes conditions mais ne contenant pas de substance d'essai. La croissance des bacteries est mesuree par turbidimetrie avec un spectrophotometre.
Le pourcentage d'inhibition de la multiplication cellulaire, H, est donne par:
H=((Bk-Bn)/(Bk-BO))x100 .
avec Bk et Bn, les turbidites respectivement dans les flacons temoins et dans les flacons d'essai (apres deduction des blancs non inocules) et BO, la turbid ite a t = 0 dans les flacons temoins.
Dans les conditions de I'etude, le^^^^Bli^lwpresente une :
CE 50-16h = 28 mg/!, avec un intervalle de confiance a 95 % egal a 16 - 41 mg/l, etune CE io-16 h = 1>2 mg/l, avec un intervalle de confiance a 95 % egal a 0,12 - 3,6 mg/l.
La substance de reference, le 3,5-dichlorophenol, presents une CE 50-16h egale a 17 mg/l et une CE -)o-16 h egale a 9,1 mg/l.
Le critere de validite mentionnant que I'inoculum utilise dans le temoin s'est multiplie par au moins un facteur 60 pendant la duree de I'essai a ete respecte (facteur de croissance = 104).
AM PETIT
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La reproduction de ce rapport d'etude n'est autorisee que sous forme de fac-simile: photagraphique integral.
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REPS3890.DOC Page 2/3
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ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levallois
Substance etudiee
Substance de reference
Demandeur de I'etude: Directeur de I'etude: Realisation technique: Date du debut de I'essai: Date de la redaction du rapport d'etude :
Reference CAL: 3890/94
Nom: 3-5 DICHLOROPHENOL Reference CAL (lot): ALDRICH 97% 633
M.DEVAUX(DCFS)
H. THIEBAUD A.M. PETIT 26/12/94
15/03/95
Preparation de I'echantillon :
Le jour de I'essai, une solution mere a 500mg/l dans I'eau ultra-pure est preparee.
Mesures des pH: Concentration
Omg/1 200 mg/1
pH en debut d'essai 6,97 7,08
pH en fin d'essai 4,65 4,54
OrQamisme test:
Pseudomonas putida ; Institut PASTEUR 103281
Materiel:
Verrerie sterilisee (Eriens de 50ml) Spectrophotometre Perkin -Elmer lambda 5 Agitateurthermostate 21 "C +/-1C
Gamme de concentrations:
Volume (m )
Solution mere ou solution mere diluee de la 4
2
1
0,5 0,25
0
substance (facteur de dilution entre parentheses)
Eau
4
6
7
7,5 7,75
8
Milieu d'essai
1
1
1
1
1
1
Inoculum
1
1
1
1
1
1
Concentration (mg/l)
200
100
50
25
12,5
0
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REPS3890.DOC Page 3/3
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r
Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putlda - Essai definitif, 16 h -
Methods decrite dans Ie projet de nonne ISO/DIS 10712
Feuille de saisie des mesurages
Substance etudiee : Nom : Ref. GAL F3890/94
Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281
Turbidite de la preculture
nombre de absorbance
mesure
(A436)
1
2
3
moyenne
#DIV/0!
FNU
#N/A #N/A #N/A #DlV/0!
Inoculum dans Ie temoin Concentration initiale (% vol): Turbidite initiale BO (A 436):
Facteur de croissance observe pendant la duree de I'essai:
10% 5,1
104
Concentration (mg/l)
0 (temoin) 12,5 25 50 100 200
Mesurage de facteur de dilution
0,05 0,20 0,25 0,33 0,50 1,00
I'absorbance Essais 1
0,112 0,288 0,257 0,315 0,279 0,510
(A436) en fin d'essai
2
0,100 0,293 0,255 0,239 0,258 0,418
3
0,098 0,238 0.244 0,279 0,290 0,566
dans les series d'essai
4
0,103
5
0,094
et Ie temoin 6
^ 1 S - a t c Q '
TSC^61
""
Co^^--^^-"^" s
Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h
M6thode dterite dans Ie projet de norme ISO/DIS 10712
Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la methode des Probits
Substance etudiee : Ref. CAL: 3890/94
Souche de Pseudomonas putida: Institut Pasteur 103281
Concentration (mg/1)
0 (temoin) 12.5 25 50 100 200 #N/A #N/A #N/A
Absorbance moyenne (A436moy)
0,101 0,273 0,252 0.278 0,276 0,498 #N/A #N/A #N/A
Turbidite
moyenne (FNU moy)
530 350 260 220 140 130 #N/A #N/A #N/A
Inhibition (%)
0,0 34,3 51,4 59,1 74,3 76,2 #N/A #N/A #N/A
CE50 = CE50>
CE50<
CE10 = CE10> CE10<
r2=
28 16 41
1,2 0,12 3,6 0,958
mg/1 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1 mg/1
#N/A: valeur non disponible. |
#NOMBRE!: valeur indeterminee.
Donnees utilisees pour Ie calcul (excluant Ie binome 0;0 du temoin)
Concentration Inhibition
PROB1T
log cone.
(mg/1)
(%)
comgee
y
x
(%)
12,5 25 50 100 200
34,3 51,4 59,1 74,3 76,2
34,3 51,4 59,1 74,3 76,2 #N/A #N/A #N/A #N/A
4,590 5,030 5,230 5,640 5,710 #N/A #N/A #N/A #N/A
1,097 1,398 1,699 2,000 2,301 #NOMBRE! #NOMBRE! #NOMBRE! iWMOMBRE!
nb valeurs 5
Somme Moyenne
26,200 5,240
8,495 1.699
^ ^ 15G33nl o'
^^SJZW-A'
Probit de la proportion inhibee en fonction du logarithme decimal de la concentration
a
Valeurs
experimentales
Droite calculee
-r 6,000
+ 5,500
4- 5,000
4,500
4,000 i
3,500
3,000 &.
2,500
4- 2,000
1,500
0.500
1,000
1,500
Logarithme decimal de la concentration
2,000
1,000 2,500
. , . 0 . ^ ' GaW?6"f11f-i ^ f-'^ . ^ s -
Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h -
Mahode diScrite dans Ie projet de norme ISO/DIS 10712
Feuilie de saisie des mesurages
Substance etudiee : Norn:
3-5 D1CHLOROPHENOL
Ref. CAL: Reference Aldrich
Souche de Pseudomonas putida : (nstitut Pasteur 103281
Turbidite de la preculture
nombre de absorbance
mesure
(A436)
1
2
3
moyenne
#DIV/0!
FNU
#N/A #N/A #N/A #DIV/0!
Inoculum dans Ie temoin
Concentration initiale (% vol): 10%
Turbidite initiale BO (A436):
5,1
Facteur de croissance observe
pendant la duree de I'essai:
104
Concentration Mesurage de I'absorbance (A436) en fin d'essai dans les series d'essai et Ie temoin
(mg/l)
facteurde Essais
dilution
1
2
3
4
5
6
0 (temoin)
0,05
0.112
0,100
0,098
0,103
0,094
10
0,25
0,449
0,405
0,436
15
0,25
0,316
0,324
0,342
20
0,25
0,249
0,243
0,281
25
1,00
0,315
0,396
0,307
30
1,00
0,060
0,028
0,720
RPSE2612.XLS
-!.-,-r>^.'i""'
Ooya?_?^1*s'-a--w-"-
Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai definitif, 16 h
MiSthode d^crite dans Ie projetde norme ISO/DIS 10712
Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la methode des Probits
Substance etudiee: Norn:
3-5 DICHLOROPHENOL
Ref. CAL : Reference Aldrich
Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281
Concentration (mg/l)
0 (temoin) 10 15 20 25 30
#N/A #N/A #N/A
Absorbance moyenne (A436moy)
0,101
0,430 0,327 0,258 0,339 0,269 #N/A #N/A #N/A
Turbidite
moyenne (FNU moy)
530 440 340 270 87 69 #N/A #N/A #N/A
Inhibition (%)
0,0 17,1 36,2 49,5 84,4 87,8 #N/A #N/A #N/A
CE50 = CE50> CE50< CE10 = CE10> CE10<
r2=
17 14 21
9,1 4,6 12
0,939
mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l
#N/A: valeur non disponible. |
#NOMBRE!: valeur indeterminee.
Donnees utilisees pour Ie calcul (excluant Ie binome 0;0 du temoin)
Concentration Inhibition
(mg/l)
(%)
corrigee (%)
PROBIT
y
log cone.
x
10
17,1
17,1
4,050
1,000
15
36,2
36,2
4,640
1,176
20
49,5
49,5
4,970
1,301
25
.84,4
84,4
5,990
1,398
30
87,8
87,8
6,130
1,477
#N/A
#N/A SOMBRE!
#N/A
#N/A
#NOMBRE!
#N/A
#N/A
#NOMBRE!
#N/A
#N/A
#NOMBRE!
nb valeurs
Somme
25,780
6,352
5
Moyenne
5,156
1,270
RPSE2612.XLS
. ^ c ^ on^ GO'5'5 n'0' '-'
.-.,&.s-
^ft1^
Probit de la proportion inhib6e en fonction du logarithme decimal de la concentration
Valeurs
3-5 DICHLOROPHENOL
[ R6f6ren;e L1--&ldrich-
-r
7,000
"-------- Droite calculee
'
j
i
!
i
/
- ^- 6,000 - 5,000
LE c:
o
'5
- 4,000 t
0-
JO
s
'-Q 0
t
- 3,000
- 2,000
|------------|------------)------------!------------\------------\------------]------------|------------ i,,,nnn
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600
Logarithme decimal de la concentration
RPSE2612.XLS
,5^^ O ^GS- ^