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Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.: ELFATOCHEM 04-Jul-95 95/SAEK/0489/AMP " AR226-3021 Bacterial Growth Inhibition Author(s): H. Thiebaud ____ Coll: A.M. Petit English Translation of Report Summary for DuPont Chemical Solutions Enterprise 27-Jan-03 S a r n ia . M M > T S C A , Company ELF ATOCHEM S.A. Levallois Applications Center TECHNICAL SUM M ARY Determination of growth inhibition of Pseudomonas putida bacteria b y l f l [ H f l H H M Was effected using the operating procedure described in proposed standard ISO/DIS 1 7 liT ( c u J o ^ 8 A fnorT90B ). The method consists in exposing the bacteria fo r 16 hours to a range of concentrations o f the substance being studied. The inhibiting effect observed on Pseudomonas putida is determ ined by com paring the cell growth at various dilutions of the substance with the cell growth obtained for a culture under the same conditions but which does not contain the test substance. The cell growth is determ ined by turbidim etry using a spectrophotom eter. The percent cell growth inhibition H is given by the relation : H = ((Bk - Bn)/(Bk - B0))x100 where Bk and Bri are the" turbidities, respectively, in the control and test flasks (after deduction of noninoculated whites) and BO is the turbidity at t = 0 in the control flasks. The in h ib itio n va lu e s o btaine d d u rin g th e p re lim in a ry te s t led us to e ffe c t a lim it te s t at th e sin q ie co n ce n tra tio n o f 100 m g /l. Under the test c o n d it io n s , |Q H B H H ^ a s an inhibition of 14 % a t a c o n ce n tra tio n o f 100 m g/i The CES0 is consequently higher than 100 mg/l. The reference substance, 3,5-dichlorophenol has a CETM -1 6 h equal to 17 mg/I and a CE10 -1 6 h equal to 10 mg/l ' The validity criteria m entioning that the inoculum used in the control grew by at least a factor of 60X for the duration of the test was respected (growth factor 195). A. M. PETIT H. THIEBAUD Company S anitize41, Does not contain TSC G . ELF ATOCHEM S.A. D.C.R.D. ) Centre d'Application de Levallois Service Analyse Environnement . Levallois le : 04/07/95 Rf. document : 95/SAEk/0489/AMP N de Squentiel : 814020 TITRE : DETERMINATION DE L'INHIBITION DE LA CROISSANCE DES BACTRIES PSEUDOMONAS PUTIDA AUTEUR(S) : H. THIBAUD Coll. A. M. P ETIT RESUME DOCUMENTAIRE : ----------- ~---------------------------------------- ds !a croissance des bactries Pseudomonas putida su,vant ie ^ode opratoire dcrit dans la mthode du projet de norme ISO /DIS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). FISO/DS 10712 J lnhibiti n de ia Croissance d5S bactries Pseudomonas putida:. ' DESTINATAIRE : M. DEVAUX (DCFS) Ce rapport comprend 3 pages et 5 feuillets non pagins (feuilles de saisie, de calcul et reprsentation graphique) Copies : Chef de Service, Responsable des Archives, Laboratoire d'cotoxicologie (copie coll ) ' Secrtariat, Fichier TECH Service Ecoroxicit et Sret des Produits (DSEP) ^c CoOPanf ELF ATOCHEM S.A. Centre d'Application de Levallois RSUM TECHNIQUE La d te n m T a tio j^ ^ in h ib itio n de la croissance des bactries Pseudomonas putida par l e f l U | H | H j | a t ralise en suivant le mode opratoire dcrit dans le projetTie norme ISO/DIS 10712 (cf. doc 118 Afnor T90 B). La mthode consiste exposer pendant 16 heures les bactries une gamme de concentrations de la substance tudie. L'effet inhibiteur sur Pseudomonas putida est dtermin par comparaison de la croissance cellulaire des diverses dilutions de substance avec la croissance cellulaire obtenue pour une culture ralise dans les mmes conditions mais ne contenant pas de substance d'essai. La croissance des bactries est mesure par turbidimtrie avec un spectrophotomtre. Le pourcentage d'inhibition de la multiplication cellulaire, H, est donn par : H = ((Bk-Bn)/(Bk-B0))x100 avec Bk et Bn, les turbidits respectivement dans les flacons tmoins et dans les flacons d'essai (aprs dduction des blancs non inoculs) et B0, la turbidit t = 0 dans les flacons tmoins. ` Les valeurs d'inhibitions obtenues au cours de l'essai prliminaire nous ont conduit effectuer un essai limite la seule concentration de 100 mg/l. Dans les conditions de l'tude, i e | J i m m 3 r s e n t e une inhibition de 14% la concentration de 100 mg/l. La CE go est par consquent suprieure 100 m g /l. La substance de rfrence, le 3,5-dichlorophnol, prsente une CE 50-16h gale 17 mg/l et une CE i 0-16 h gale 10 mg/l. Le critre de validit mentionnant que l'inoculum utilis dans le tmoin s'est multipli par au moins un facteur 60 pendant la dure de l'essai s t respect (facteur de croissance 195). Com pany S anitized. Does not contain TSC CI# Ce document est a proprit tffcLF ATOCHEM. i! ne peut tre ni copie, ni communiqu des tiers sans autorisation formate l.b reproauction ae ce rapport oeturie n'est autorise aue sous forme rie fac-simii Dhoioarspnique 'ntara! REPS2S7S.DOC Page 2/3 - - ELF ATOCHEM S.A. Centre d'Application de Levaliois ESSSAi D' INHIBITION DE LA CROISSANCE DE PSEUDOMONAS PUTIDA tmthode decr.te dans le projet oa norme iSO/DIS '.0712 a a o - 115 Arno- T 9 0 B i Substance tudie Substance de rfrence Demandeur de l'tude : Directeur de l'tude : Ralisation technique : Date du dbut de l'essai ; Date de la rdaction du rapport ri'tnrfe : Nom : 3-5 Dichiorophnol Rfrence lot : Aldrich 97% 633 M. Devaux (DCFS) H.Thibaud A. M.Petit 23/5/95 04/07/95 Prparation de l'chantillon Le jour de l'essai, une solution mre 1 g/l dans le milieu d'essai est prpare. Mesures des nH Concentration 0 ma/l 100 ma/l pH en dbut d'essai 6,66 7,18 pH en fin d'essai 7,15 7,12 Oraamisms test Pseudomonas putida ; Institut PASTEUR 103281 Matriel : . Gamme de concentrations ; Verrerie strilise (Erlens de 50 ml) Spectrophotomtre Perkin -Elmer lambda 5 Agitateur thermostal 21X +/-1 C * Volume Solution mre ou solution mre dilue de la substance (facteur de dilution entre parenthses) Eau Milieu d'essai Inoculum (ml) Concentration (mg/f) 100 r ~ ^ t a in T S C A C B f Ia n itiz e d .D 00 CS Le r-P-wQu-j., oe d'ELF ce .apport d iuas n " ns Dsu; tr TM est autorise que sots TM= TM forme de q u des tiers sans autosaton fac-simii Dharoaraohiaue imora> to n a te REPS2S7S.DOC Page 3/S - - 1 / ----------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------- ---------------------------------------------------------- -- --------------------------------------------------------------------------------------------------- Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h - Mthode dcrite dans le projet de norme ISO /DIS 10712 J Feuilie de saisie des mesurages Substance tudie Nom Rf. C, Souche de Pseudom onas putida : institut rasteuM 03281 \ Turbidit de la prculture nombre de absorbance mesure (A436) 1 0,199 2 0,197 3 0,196 moyenne 0,197 FNU 50,60 50,08 49,83 50,17 Inoculum dans ie tm oin Concentration initiale (% vol) : Turbidit initiale B0 (A 436) : Facteur de croissance observ pendant la dure de Cessai : 10% 5,0 195 Concentration Mesurage de I absorbance (A 4 3 6 ) en fin d'essai dans les sries d'essai et le tmoin (mg/l) 0 (tmoin) facteur de dilution 0,04 Essais 1 0,169 2 0,159 3 0,153 4 0,158 5 0,137 Tmoin 6 Substance 100 0,10 0,324 0,341 0,324 I ----------- ------ CACSl n 0e s n o tc ^ ta ln ' itlzed ;om pany.S an 2 Essai d'inhibition de fa croissance de Pseudomonas putida - Essai d finitif 16 h Mthode dcrite dans le projet de norme ISO /D IS 10712 ' Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la - ________________ mthode des Probits Substance tudie : Nom Rf. CAL Souche de Pseudomonas putida : institut PasteuM 03281 Concentration Absorbance Turbidit (mg/I) moyenne moyenne (A436moy) (FNU moy) 0 (tmoin) 100 #N/A 0,155 0,330 #N/A 980 840 #N/A #N/A #N/A I #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A inhibition (%) 0,0 14,4 #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A CE50 = #NOMBRE! CE50 > #NOMBRE! _E5Q_<_#NOMBREi CE10 = #NOMBRE! CE10> #NOMBRE! CE10< #NOMBRE! r2 = #NOMBRE! m g/l mg/l mg/i m g/ mg/l mg/l |#N/A : valeur non disponible. J |#NOMBRE! : valeur indtermine. Concentration Inhibition (mg/i) (%) 100 14.4 -i nb valeurs 1 corrige (%) 14.4 #N/A #N/A rrN/A #N/A I #N/A #N/A #N/A #N/A Somme Moyenne wwmumc U,U ju tmoin) PROBii iog conc. yX 3.920 #N/A #N/A *#N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A 3,920 3,920 2 000 #no_m b r e i #NOMBREi IrNOMBRE1 #NOMBR!=i #NOMBREi #NOMBRE* NOMBRE i #NOMBRE< 2,000 2,000 I nQt cantata TSC A CEI .D oes 1 Essai d 'in h ib itio n de fa croissance de Pseudomonas putid a - Essai d fin itif, 16 h - Mthode dcrite dans le projet de norme ISO /DIS 10712 Feuille de saisie des mesurages Substance tudie Nom : 3-5 D ichiorophnol Rf. CAL Aldrich 97% 633 Souche de Pseudom onas putida : In stitu t Pasteur 103281 Turbidit de la prculture nombre de absorbance mesure (A436) 1 0,199 2 0,197 3 0,196 moyenne 0,197 FNU 50,60 50,08 49,83 50,17 inoculum dans le tm oin Concentration initiale (% vol) : Turbidit initiale B0 (A 436) : Facteur de croissance observ pendant la dure de l'essai : 10% 5,0 195 Concentration Mesurage ae i absorbance (A45 ) en fin d'essai dans les sries d'essai et ie tmoin (mg/I) 0 (tmoin) 30 facteur de dilution 0,04 1,00 Essais 1 0,169 0,476 2 0,159 0,439 3 0,153 0,504 4 0,158 5 0,137 Tmoin 6 Substance 25 1,00 0,755 0,736 0,100 20 0.20 0.155 1 0.141 0.158 15 0,20 0,458 0,431 0,433 10 0,10 0,341 0.376 0,373 QOOStVOl S a n it ts c a L 2 Essai d inhibition de la croissancie de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h - . Mthode dcrite dans le projet de norme ISO /D IS 10712 ' Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la Li ______________ mthode des Probits Substance tudie Nom 3-5 Dichiorophnol Rf. Cw -AML- ,: Aruludnriuchn g97/ % 633 souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103261 Concentration (mg/I) 0 (tmoin) 30 25 20 15 10 #N/A # N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 1S 0,473 0,530 0,151 0,441 0,363 #N/A #N/A #N/A Turbidit moyenne (FNU moy) 980 120 140 190 560 930 #N/A #N/A *N /A | Inhibition (%) 0,0 88,2 86,2 81,0 43,1 5,1 #N/A #N/A #N/A CE50 = CESO > CE50 < CE10 = CE10 > CE10 < r2 = 17 13 21 10 5,6 13 0,932 m g/l m g/l m g/l m g/I mg/l mg/l f =3 #N/A : valeur non disponible. | #NQMBREi : valeur indtermine. [Uonnees utilises pour le calcul (excluant le binme n-n h.i tmoins j uonceiiiration inhioition (mg/l) (%) corrige PROBFT I log conc. yX 30 88,2 25 86,2 20 81,0 15 - 43,1 10 5,1 | I (%) 88.2 86,2 81.0 43.1 5,1 #N/A #N/A #N/A 6.180 6,080 5.880 4.820 3.360 #N/A #N/A #N/A 1,477 1,398 1,301 1,176 1.000 #NOMSRE! #NOMBREi #NOMBRE! nb valeurs _5 Somme [ Moyenne #N/A 26,320 5,264 ^NOMBRE! 6,352 1,270 3 Profait de ia proportion inhibe en fonction du logarithm e dcim ai de ia concentration i - - 3,000 -- 2,000 ' 0,000 ' 0,200 : ----------- ---------- 1------------ :------------ - 1,000 0,400 0,600 0,800 1,000 ' 1,200 Logarithm e dcim al de la concentration 1,400 1,600 ,, ,, ic o n 0 * 081