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Vorabverffentlichung: Untersuchungsergebnisse zu PFAS in Coffee- to-go-Bechern und anderen Streetfoodverpackungen Andrea Dombrowski (Goethe-Universitt Frankfurt), Dr. Sandy Falk (Landesbetrieb Hessisches Landeslabor), Dr. Sebastian Georgii (Landesbetrieb Hessisches Landeslabor), Prof. Dr. Henner Hollert (Goethe-Universitt Frankfurt), Dr. Sarah Johann (GoetheUniversitt Frankfurt), Prof. Dr. Oehlmann (Goethe-Universitt Frankfurt) Zusammenfassung Um den mglichen Eintrag persistenter, potentiell toxikologisch relevanter per- und polyfluorierter Alkylsubstanzen (PFAS) in die Umwelt und in Nahrungsmittel zu untersuchen, wurden im Landesbetrieb Hessisches Landeslabor (LHL) im Rahmen eines Projektes ausgewhlte Lebensmittelkontaktmaterialien, die ber die amtliche Lebensmittelberwachung eingesendet wurden, auf das Vorkommen fluorierter Verbindungen untersucht. Unter den insgesamt 54 in Hessen vertriebenen Lebensmittekontaktmaterialien befanden sich beschichtete Coffee-to-go-Becher, beschichtete Pappcontainer (Foodtrays), Papierbeutel fr Lebensmittel sowie Backpapier und Muffinfrmchen aus Papier. 36 Lebensmittelkontaktmaterialien wurden auf das Vorkommen organischen Fluors mit Hilfe des Summenparameters "total fluorine" (TF) untersucht. Anschlieend wurden sechs der untersuchten Proben mittels Einzelstoffanalytik auf insgesamt 96 PFAS-Einzelverbindungen untersucht, um mgliche eingesetzte Substanzen zu identifizieren. An ausgewhlten Proben wurde mittels des AOF-Summenparameters zudem untersucht, ob fluorierte Verbindungen aus dem Lebensmittelkontaktmaterial in wssrige und ethanolische Migrate (Lebensmittelsimulanzien) bergehen. Eine Auswahl der untersuchten Extrakte und Migrate wurde weiterhin mit Hilfe sieben verschiedener Bioassays hinsichtlich ihrer biologischen Aktivitt untersucht. Dabei ist auch die biologische Aktivitt in Abhngigkeit der Migrationsdauer betrachtet worden. Um die beobachteten Effekte mglichen Substanzen zuzuordnen, sind Migrate in einer weiteren Untersuchungsreihe dem TTR TR CALUX-Test unterzogen worden, der effektbasiert spezifisch auf PFAS reagiert. Bislang gibt es in Deutschland keinen Richtwert fr das Vorkommen fluorierter Verbindungen in Lebensmittelkontaktmaterialien. Dnemark ist das einzige europische Land, in dem seit Juli 2020 ein Richtwert fr organisch gebundenes Fluor in Lebensmittelkontaktmaterialien festgelegt wurde, dieser Richtwert liegt bei 20 Milligramm pro Kilogramm (mg/kg) Material. Oberhalb dieses Gehaltes geht man von einem gezielten Einsatz fluorierter Verbindungen aus, whrend bei Gehalten <20 mg/kg auch Verunreinigung urschlich sein knnen. In dem am 7. Februar 2023 von der ECHA verffentlichten Beschrnkungsvorschlag fr die PFAS-Stoffgruppe bzw. dem zugrundeliegenden Bericht nach Anhang XV der REACH-Verordnung ist fr die berwachung in Ziffer 2.iii. als Grenzwert fr PFAS insgesamt (einschlielich polymerer PFAS), gemessen als Gesamtfluorgehalt von 50 mg/kg angegebenen. Die Untersuchungen zeigen, dass Lebensmittelkontaktmaterialien, die fluorierte Verbindungen enthalten, mittels des Screening Verfahrens TF - bedingt auch mittels AOF - identifiziert werden knnen. In ber der Hlfte aller untersuchten Lebensmittelkontaktmaterialien wurden TF-Gehalte oberhalb von 20 mg/kg nachgewiesen. Die TF-Gehalte der Materialien lagen zwischen 1,1 und 912 mg/kg. Mittels Einzelstoffanalytik mit 96 Analyten lie sich jeweils nur ein niedriger Prozentteil der in den Proben festgestellten Fluorgehalte identifizieren und spezifischen PFAS-Verbindungen zuordnen. Im Ergebnis ist auerdem festzustellen, dass keine der untersuchten Migrate hinsichtlich der biologischen Aktivitt unauffllig war. Bei den untersuchten Kaffeebechern sind in den Migraten insbesondere anti-estrogene und Dioxin-hnliche Effekte nachgewiesen worden; bei Meal-to-goBoxen waren es toxische, estrogen- und Dioxin-hnliche. Bedenkliche biologische Wirkungen traten dabei sptestens nach zehn Minuten Kontaktzeit auf. Der TTR TR CALUX-Test zeigt, dass Effekte in den untersuchten Migraten auf PFAS zurckgefhrt werden knnen. Hierbei konnten fr die einzelnen Lebensmittelkontaktmaterialien deutliche Unterschiede bezglich des durch PFAS induzierten potentiellen Eingriff in das Thyroidsystem beobachtet werden. Einleitung PFAS (vormals auch PFC - per- und polyfluorierte Chemikalien) sind Verbindungen anthropogenen Ursprungs die, wie auch andere persistente halogenorganische Verbindungen, zu den ubiquitr vorkommenden Kontaminanten zhlen. Bei perfluorierten Alkylsubstanzen handelt es sich um organische Verbindungen, bei denen alle Wasserstoffatome an der Kohlenstoffkette - mit Ausnahme der Wasserstoffatome, die Bestandteil funktioneller Gruppen sind - vollstndig durch Fluoratome substituiert sind. Polyfluoralkylverbindungen hingegen sind Verbindungen bei denen die Wasserstoffatome am Kohlenstoffgerst nur teilweise, aber nicht vollstndig durch Fluoratome substituiert sind. Die Stoffgruppe der PFAS wird nach der OECD-Definition1 anhand ihrer chemischen Struktur definiert - alle PFAS-Verbindungen enthalten eine oder mehrere vollstndig fluorierte Methyl- (-CF3) oder Methylengruppen (-CF2-), wobei - etwas vereinfacht - keine unmittelbare Bindung zu einer Amin-, Alkohol- oder Carbonylgruppe bestehen darf. Die Stoffgruppendefinition fut auf der auerordentlich hohen chemischen und thermischen Stabilitt vollstndig fluorierter Methyl-/ Methylengruppen. Man geht derzeit davon aus, dass bis zu 10.000 Verbindungen der Gruppe der PFAS zuzuordnen sind. PFAS sind thermisch und chemisch sehr stabil und besitzen teilweise ambiphile Eigenschaften, weshalb diese seit den 1950er Jahren in zahlreichen industriellen Prozessen, aber auch in privaten Haushalten zum Einsatz kommen. PFAS werden ab einer Kettenlnge von sechs (Perfluoralkylsulfonsuren) bzw. sieben perfluorierten Kohlenstoffatomen (Perfluoralkycarbonsuren) als langkettig bezeichnet, sind vergleichsweise schlecht wasserlslich und besitzen im Vergleich zu kurzkettigen PFAS eine hohe Bindungsaffinitt gegenber organischem Material. Daher werden kurzkettige PFAS berwiegend in wssrigen Matrizes wie Oberflchen-, Grund- und Regenwasser sowie Schnee nachgewiesen und scheinen sich unter anderem ber den Wasserpfad global zu verteilen; wohingegen langkettige PFAS eine vergleichsweise hohe Bindungsaffinitt gegenber organischem Material besitzen, in Umwelt und 1 Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) (2021) Series on Risk Management No. 61: Reconciling Terminology of the Universe of Per- and Polyfluoroalkyl Substances: Recommendations and Practical Guidance. https://www.oecd.org/chemicalsafety/portal-perfluorinated-chemicals/terminology-per-and-polyfluoroalkylsubstances.pdf. Lebewesen sehr langlebig sind und sich in verschiedenen Organismen entlang von Nahrungsketten bis hin zum Menschen anreichern knnen. Materialien und Methoden Dem Landesbetrieb Hessisches Landeslabor (LHL) wurden XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX insgesamt 54 Lebensmittelkontaktmaterialien eingesendet. Unter den Proben befanden sich beschichtete Coffee-to-go-Becher aus Pappe, Pappteller, fett- und wasserabweisende Papier- und Folienverpackungen fr Burger, Dner und Torten, beschichtete Pappcontainer (Foodtrays, Salatschalen, Burger- und Sandwichboxen), Papierbeutel fr Lebensmittel, Backpapiere sowie Muffinfrmchen aus Papier. Die verschiedenen Probenarten, ihre Materialien sowie die Probenanzahl sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1: Untersuchte Materialien Probenart Beschichtete Kaffeebecher Essenscontainer aus beschichteter Pappe Beschichtete Papier- und Folienverpackungen Papierfrmchen Papierbeutel Backpapiere Pappteller Musterfolien fr Lebensmittelkontaktmaterialien Bestimmung/Material Einmal-Trinkbecher und Coffee-to-go-Becher auf Cellulosebasis Salatschalen, Sandwichboxen, Burgerboxen, Foodtrays Verpackungen fr Burger, Torten, Dner Muffinfrmchen, Backfrmchen Imbiss-/Snack-/Bckereitten Backpapierzuschnitte auf Cellulosebasis bedruckt teilweise bunt bedruckt Folie fr Lebensmittelverpackungen teilweise Anzahl 19 16 6 5 2 3 2 1 Extraktionsverfahren Fr Untersuchungen am Extrakt wurden die Proben zunchst zerkleinert und anschlieend extrahiert. Die Extraktionsbedingungen wurden so gewhlt, dass sie mglichst ein ,,worst-case-Szenario" abdecken, dazu wurde aus den zerkleinerten Proben einerseits ein Heiwasserextrakt (in Anlehnung an DIN EN 6472) andererseits ein ethanolischer Extrakt (in Anlehnung an Trier et al. 20113 und VO (EU) Nr. 10/20114) hergestellt. 2 DIN EN 647:1994-01. Papier und Pappe vorgesehen fr den Kontakt mit Lebensmitteln; Herstellung eines Heiwasserextraktes; Deutsche Fassung EN 647:1993 3 Trier X, Granby K, Christensen JH (2011). Polyfluorinated surfactants (PFS) in paper and board coatings for food packaging. Environmental science and pollution research international, 18:1108-1120. 4 VERORDNUNG (EU) Nr. 10/2011 ber Materialien und Gegenstnde aus Kunststoff, die dazu bestimmt sind, mit Lebensmitteln in Berhrung zu kommen vom 14. Januar 2011. Heiwasserextraktion Fr die Heiwasserextraktion wurden je 50 cm aus zwei identischen Prfmustern entnommen (entsprechend einer Gesamtprobenflche von 1 dm). Die Proben wurden in 1 bis 2 cm groe Stcke geschnitten, in ein verschliebares Glasgef gegeben, mit 40 mL Wasser (auf 70 C vorgewrmt) aufgefllt. Das Glasgef wurde verschlossen und im vorgeheizten Ultraschallbad zwei Stunden bei konstanter Temperatur (70 C) extrahiert. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekhlt und mittels Faltenfilter filtriert. Fr die weitere Aufarbeitung und Messung wurde jeweils ein Aliquot von 20 ml entnommen. Ethanolische Extraktion Fr die ethanolische Extraktion wurden je 50 cm aus zwei identischen Prfmustern entnommen (entsprechend einer Gesamtprobenflche von 1 dm). Die Proben wurden in 1 bis 2 cm groe Stcke geschnitten, in ein verschliebares Glasgef gegeben und mit 40 mL Ethanol (95 % v/v), das zuvor auf 70 C erwrmt wurden, aufgefllt. Das Glasgef wurde verschlossen und im vorgeheizten Ultraschallbad zwei Stunden bei konstanter Temperatur (70 C) extrahiert. Der berstand (In-vitroAssays), bzw. ein Aliquot von 20 mL (AOF), wurde in einen geeigneten Rund- oder Spitzkolben berfhrt und mittels Rotationsverdampfer auf 1-2 mL eingeengt. Die Probe wurde zur weiteren Aufarbeitung und Messung in einem geeigneten Volumen Wasser (AOF) bzw. DMSO (In-vitro-Assays) rekonstituiert. Migrationsverfahren Die Migrationsversuche wurden mithilfe ethanolischer Lsung (95 % vol) als Lebensmittelsimulanz fr fetthaltige Lebensmittel und Getrnke und wssriger Migrationslsung als Lebensmittelsimulanz fr Lebensmittel mit hydrophilen Eigenschaften einschlielich Getrnken in Form einer Heiwassermigration ber zwei Stunden bei 70 C im Trockenschrank durchgefhrt. Die Migrationsbedingungen erfolgten in Anlehnung an VO (EU) Nr. 10/2011. Die Gehalte wurden unter Bercksichtigung der eingesetzten Migrationslsungsvolumina auf die Kontaktflche bezogen. Die Essenscontainer und die Backfrmchen haben den Migrationsbedingungen bei 70 C nicht standgehalten, alternativ wurde daher bei diesen Proben die Migration mit wssriger Simulanz fr zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgefhrt. Fr die Untersuchung der zeitabhngigen biologischen Aktivitt wurde die Migration jeweils nach 5, 10, 20, 40 und 60 Minuten gestoppt. Bestimmung des Summenparameters ,,total fluorine" (TF) In der Verbrennungs-Ionen-Chromatographie (engl. Combustion Ion Chromatography, CIC) wird ein Hochtemperaturverbrennungsofen mit Absorptionsmodul mit einem Ionenchromatographen (IC) gekoppelt. Diese Gertekonfiguration ermglicht die Umsetzung organischer Verbindungen in anorganische Derivate mittels kontrollierter Verbrennung und anschlieender Bestimmung der gebildeten anorganischen Ionen mittels IC. Beim Parameter ,,Totale Fluorine" (TF) genannt, wird der Gesamtfluorgehalt einer feste Probe (hier Papier) mittels CIC (Combustion Ion Chromatography) bestimmt. Das Probenmaterial wird getrocknet, zerkleinert und bei ca. 1.000 C verbrannt. Die Verbrennungsgase werden im Wasser absorbiert und die gebildeten Fluoride werden mittels Ionenchromatographie quantifiziert. Der TF wird von einigen Laboren standardmig fr die summarische Bestimmung fluorierter Verbindungen in Lebensmittelkontaktmaterialien eingesetzt. Zu den summarisch erfassbaren organischen Fluorverbindungen gehren Per- und polyfluorierte Alkylsubstanzen (PFAS) sowie fluorierte Pflanzenschutzmittel und Arzneimittel. Die TF-Bestimmung wurde vom Institut Eurofins Umwelt Ost GmbH durchgefhrt. Bestimmung des Summenparameters ,,adsorbierbares organisches Fluor" (AOF) Beim Parameter AOF werden die fluorierten organischen Probeninhaltsstoffe (organische Fluorverbindungen) wssriger Matrizes an Aktivkohle adsorbiert. Die angereicherte Aktivkohle wird bei 1.000 C im Sauerstoff/Argon-Strom verbrannt. Die dabei gebildeten Fluoride werden durch Ionenchromatographie mit Leitfhigkeit-Detektion bestimmt. Die im LHL entwickelte CIC-Methode fr die Bestimmung des Summenparameters AOF ermglicht eine Bestimmung der organischen Fluorverbindungen in wssrigen Umweltmatrizes5 und wird als akkreditierte Hausmethode fr Umweltuntersuchungen verwendet, ist bislang jedoch fr die Bestimmung von Migraten aus Lebensmittelkontaktmaterialien nicht validiert und akkreditiert. Die durchgefhrte Analytik hatte daher den Charakter einer Screening-Untersuchung. Bestimmung ausgewhlter PFAS-Einzelverbindungen Die Untersuchung sechs ausgewhlter Proben auf insgesamt 96 Einzelverbindungen erfolgte beim SGSInstitut Fresenius. Die Bestimmung von insgesamt 83 Einzelverbindungen (darunter Per- und Polyfluorierte Perfluoralkylcarbon- und Perfluoralkylsulfonsuren, ADONA, Perfluoralkylphosphonsuren, PAPs und diPAPs) erfolgte mittels LC-MS/MS nach Extraktion und anschlieender Aufreinigung und Anreicherung der Analyten, weitere 13 Verbindungen (darunter Fluortelomeralkohole und Fluoracrylate) wurden mittels GC-MS analysiert. Effekt-basierte Bestimmung der toxischen Wirkung Ein Teil der vom LHL chemisch-analytisch charakterisierten Lebensmittelkontaktmaterialien (vier Kaffeebecher, zwei Essenscontainer und ein Papierfrmchen) wurden an der Goethe-Universitt (GU) auf ihre biologische Aktivitt bzw. toxische Wirkung mit Hilfe effekt-basierter In-vitro-Assays untersucht. Dafr wurden von den Lebensmittelkontaktmaterialen mit dem bereits oben beschriebenen Verfahren Heiwasser- und ethanolische Extrakte sowie wssrige und ethanolische Migrationslsungen mit einer Temperatur der genutzten Flssigkeiten von 70 C hergestellt. Fr die Testung in den In-vitro-Assays wurden die Extrakte und Migrationslsungen ber eine Festphasenextraktion (SPE - solid phase extraction mit Oasis HLB-Kartuschen gem Herstellervorgaben) angereichert und in Dimethylsulfoxid mit einem Anreicherungsfaktor von 1.000 (ethanolische Migrate) oder 2.500 (wssrige Migrate) berfhrt. Zustzlich zu den zwei Stunden dauernden Migrationsversuchen, wurde auch eine zeitabhngige Migration von vier zuvor aufflligen Lebensmittelkontaktmaterialien durchgefhrt. Dafr wurde die Migration jeweils nach 5, 10, 20, 40 und 60 Minuten gestoppt und die Basistoxizitt (Mikrotox-Assay) 5 von Abercron E, Falk S, Stahl T, Georgii S, Hamscher G, Brunn H, Schmitz F (2019). Determination of adsorbable organically bound fluorine (AOF) and ad-sorbable organically bound halogens as sum parameters in aqueous environmental samples using combustion ion chromatography (CIC). Sci Total Environ 673: 384-391. und die Dioxin-hnliche Aktivitt, bei zwei Kaffeebechern zustzlich auch die auffllige anti-estrogene Aktivitt, bei zwei Streetfoodverpackungen die estrogene Aktivitt ermittelt. Die Basistoxizitt der Proben wurde im Mikrotox-Assay mit dem Bakterium Aliivibrio fischeri gem der ISO-Richtlinie 1134 8-3:2007 ermittelt6. Die Hemmung der Lumineszenz von Leuchtbakterien ist dabei der erfasste Parameter fr die auch als unspezifische Toxizitt bezeichnete Basistoxizitt der Inhaltsstoffe des untersuchten Extrakts oder Migrats. Die Mutagenitt der Proben wurde im Ames-Fluktationstest mit dem Bakterium Salmonella typhimurium gem ISO-Richtlinie 11350:20127 mit den Bakterienstmmen YG 1041 und YG 1042, jeweils mit und ohne S9-Mix ermittelt. Die im Test eingesetzten Mangelmutanten von S. typhimurium sind nicht in der Lage, in Histidin-freiem Medium zu berleben. Eine mutagene Probe fhrt zu einer Rckmutation und dem berleben der Bakterien. Sofern der Anteil der Rckmutationen 20,8 % berschreitet, ist die Probe mutagen. Der S9-Mix ist eine Prparation einer Mischung von Leberenzymen und wird eingesetzt, um die enzymatische Umwandlung von Substanzen in der Leber in In-vitro-Testverfahren zu simulieren, bei der aus einer nicht mutagenen Ausgangssubstanz mutagene Metabolite entstehen knnen. Die rezeptorvermittelte endokrine (hormonhnliche) Aktivitt der Proben wurde ber rekombinante Hefe-Reportergen-Assays ermittelt. Die Hefen (Saccharomyces cerevisiae) exprimieren das humane Gen fr den Estrogenrezeptor bzw. den Testosteronrezeptor, so dass eine Aktivierung bzw. Blockade der Rezeptors erfasst werden kann. Die Durchfhrung erfolgte gem ISO-Richtlinie 19040-1:20188. Die estrogene Aktivitt wurde im YES (yeast estrogen assay), die androgene Aktivitt im YAS (yeast androgen assay), die anti-estrogene Aktivitt im YAES (yeast anti-estrogen assay) und die antiandrogene Aktivitt im YAAS (yeast anti-androgen assay) ermittelt. Analog zu den endokrinen Aktivitten wurde die Dioxin-hnliche Aktivitt ebenfalls mit einem rekombinanten Hefe-Reportergen-Assay ermittelt, dem YDS (yeast dioxin screen). Die Hefen (Saccharomyces cerevisiae) exprimieren in diesem Fall das humane Gen fr den ArylhydrocarbonRezeptor (Ah- oder Dioxin-Rezeptor), der eine wichtige Rolle bei der Induktion des Phase IMetabolismus und damit bei der Umwandlung von aufgenommenen Fremdstoffen im Organismus spielt, was gegebenenfalls zur Bildung giftigerer Metabolite fhren kann. PFAS spezifische TTR-disruptive Aktivitt Die rezeptorvermittelte TTR-disruptive Aktivitt spezifischer PFAS-Komponenten wurde mittels des TTR-TR-CALUX-Tests untersucht. In diesem Test wurden die ethanolischen Migrate ausgewhlter Lebensmittelkontaktmaterialen in einer Verdnnungsreihe mit einem maximalen Anreicherungsfaktor von 1.000 untersucht. In diesem Versuch wurde die humane Osteosarkom-Zelllinie U2-OS mit dem stabil integrierten Reportergen fr die Expression des humanen Thyroidrezeptors (TR) verwendet. Das zellbasierte Testverfahren nutzt die Wechselwirkung von PFAS-Chemikalien mit dem menschlichen Schilddrsenhormonsystem und ist ein zweistufiges Verfahren. 6 ISO 11348-3:2007. Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 1: Method using freeze-dried bacteria 7 ISO 11350:2012 . Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome fluctuation test (Ames fluctuation test) 8 ISO 19040-1:2018. Water quality -- Determination of the estrogenic potential of water and waste water -- Part 1: Yeast estrogen screen (Saccharomyces cerevisiae) Der erste Schritt des Verfahrens stellt der Bindungassay dar. In diesem Test binden PFAS oder strukturell hnlichen Komponenten an das Protein Transthyretin (TTR), das als Transportprotein fr die Schilddrsenhormone des Menschen dient. Dabei wird das natrliche Hormon Thyroxin (T4) durch PFAS-Chemikalien aus dem Transportprotein verdrngt. Neben der unbekannten Probe (mit PFAS Komponenten) wurde zudem Perfluoroctansure (PFOA) als Positivkontrolle und Referenzsubstanz fr PFAS in bekannten Konzentrationen eingesetzt und ebenfalls mit T4 und TTR inkubiert. Nach einer kurzen Inkubationszeit der Probe (inklusive PFAS-Komponenten) oder des PFOA mit natrlichem T4 und TTR werden die Komponenten ber ein Biogel aufgetrennt, sodass nur TTR-T4 und TTR-PFAS Komplexe eluiert werden. Whrend einer anschlieenden kurzen Dissoziationszeit zerfallen smtliche TTR-Komplexe in die Einzelkomponenten im Eluat und das Eluat wird im zweiten Schritt, dem TRCALUX, untersucht. Hierbei wird im Eluat enthaltenes T4 an den TR binden und aufgrund des Luminszenz-induzierten Signals in Relation zu einer Referenzsubstanz (Triiodthyronin, T3) quantifiziert werden. Die Quantifizierung der spezifischen Aktivitt erfolgte anhand der Refenzsubstanz PFOA und wurde als g PFOA-quivalent / L Probe berichtet. Die Methode des TTR-TR CALUX ist damit ein negativkorreliertes, indirektes Nachweisverfahren von PFAS oder strukturell hnlichen Substanzen. Je hher das Signal im TR-CALUX, desto weniger PFAS ist in der ursprnglichen Probe enthalten, da die ursprnglich eingesetzte T4 Menge nicht verdrngt wurde. Die Durchfhrung des TTR-Bindungsassays erfolgte anhand der Standardprozedur von BDS9. Der TR-CALUX wurde nach Collet et al. 2020 durchgefhrt10. Ergebnisse Gesamtfluorgehalt In den 16 untersuchten Kaffeebecherproben wurden mittels TF-Analytik Gesamtfluorgehalte zwischen 1,1 mg/kg und 131 mg/kg festgestellt (Tabelle 1. In 20 Proben unterschiedlicher Lebensmittelkontaktmaterialien (Foodtrays, Backfrmchen, Backpapierzuschnitten und Papiertten) wurden TF-Gehalte zwischen 2,4 mg/kg und 912 mg/kg festgestellt (Tabelle 1. Die vier hchsten TF-Gehalte wurden in zwei Muffin-/Backfrmchen und zwei Foodtrays nachgewiesen (TF-Gehalte zwischen 912 mg/kg und 834 mg/kg). Die Einzelbefunde der TF-Untersuchungen sind in Tabelle 2 und Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 2: Untersuchte Materialien (Coffee-to-go Becher) Art des Lebensmittelkontaktmaterials Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Gesamtfluor TF (mg/kg) 1,1 1,3 2,3 2,4 2,5 3 Material Innenseite (FTIR-Ergebnis) Cellulose Polyethylen Polyethylen Cellulose Polyethylen Polyethylen Material Auenseite (FTIR-Ergebnis) Cellulose fraglich/nicht eindeutig spezifizierbar Cellulose Cellulose Cellulose Hinweis auf Calciumcarbonat, -sulfat 9 BiodetectionSystem (BDS) Standard Operation Procedure, p-bds-144, Version D, Nov 2019. 10 Collet, Brnice, et al. "Evaluation of a panel of in vitro methods for assessing thyroid receptor and transthyretin transporter disrupting activities." Reproductive Toxicology 96 (2020): 432-444. Art des Lebensmittelkontaktmaterials Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Trinkbecher Gesamtfluor TF (mg/kg) 3,7 5,8 34,2 40,2 51,2 57 70,5 77,2 123,1 130,9 Material Innenseite (FTIR-Ergebnis) Polyethylen Hinweis auf Poly(Acrylic Acid)ethylene Polyethylen Cellulose Polyethylen Polyethylen Cellulose Polyethylen Hinweis auf Talkum Polyethylen Material Auenseite (FTIR-Ergebnis) Hinweis auf Styrol-Acrylnitril-Copolymer Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Tabelle 3: Untersuchte Materialien (sonstige Lebensmittelkontaktmaterialien) Art des Lebensmittelkontaktmaterials Foodcontainer/ Foodtray Burgerpapier Foodcontainer/ Foodtray Backpapier Hamburgerboxen/ Sandwichchboxen aus Pappe Foodcontainer/ Foodtray Foodcontainer/ Foodtray Foodcontainer/ Foodtray Backfrmchen Imbiss-/Snack-/ Bckereitte, Papierverpackung Backfrmchen Foodcontainer/ Foodtray Papierfrmchen Papierfolie Schalen aus Holzschliff Foodcontainer/ Foodtray Backfrmchen Foodcontainer/ Foodtray Foodcontainer/ Foodtray Muffinfrmchen Gesamtfluor TF (mg/kg) 2,4 3,3 6 11,4 12 16,1 16,1 18 19,8 38,1 47,3 113,2 405 603 617 726,9 834,3 848,2 853,8 912 Material Innenseite (FTIR-Ergebnis) Cellulose nicht bestimmt fraglich/nicht eindeutig spezifizierbar Cellulose nicht bestimmt Polyethylen Cellulose Polylactat Hinweis auf Talkum Polyethylen Hinweis auf Poly(Acrylic Acid)ethylene Polyethylen nicht bestimmt nicht bestimmt nicht bestimmt Hinweis auf keramische Bestandteile Polylactat Cellulose Polyethylen nicht bestimmt Material Auenseite (FTIRErgebnis) Cellulose nicht bestimmt Cellulose Cellulose nicht bestimmt Cellulose Cellulose Cellulose Cellulose Hinweis auf Kreide (Calciumcarbonat, -sulfat) Hinweis auf Polyesterharz Polyethylen nicht bestimmt nicht bestimmt nicht bestimmt Hinweis auf Acrylfarbe Cellulose Cellulose Cellulose nicht bestimmt Die Verteilung der Befunde fr die Coffee-to-go-Becher und die brigen Lebensmittelkontaktmaterialien ist in der Abbildung 1 dargestellt. In acht der 16 untersuchten Coffee-to-go-Becher wurden Gehalte oberhalb des dnischen Richtwertes von 20 mg/kg festgestellt. In zwei Proben (12 %) wurden Gehalte zwischen 20 mg/kg und 50 mg/kg Papier festgestellt. Sechs Proben wiesen Gehalte ber 50 mg/kg Papier auf (38 %). In elf der insgesamt 20 Proben sonstiger Lebensmittelkontaktmaterialien (Food-Trays, Backpapieren, Muffinfrmchen und Papiertten) und somit in ber der Hlfte der Proben, wurden Gehalte oberhalb des dnischen Richtwertes von 20 mg/kg nachgewiesen. In zwei Proben (10 %) wurden Gehalte zwischen 20 und 50 mg/kg Papier festgestellt. Neun der Proben und somit 45 % wiesen Gehalte ber 50 mg/kg Lebensmittelkontaktmaterial auf. Im oberen Konzentrationsbereich von >100 mg/kg lagen neun Proben der sonstigen Lebensmittelkontaktmaterialien, bei den Coffee-togo-Bechern waren es hingegen nur zwei. Coffee-to-go-Becher (n=16) sonstige Lebensmittelkontaktmateriali en (n=20) 38% 50% 45% 45% 12% TF < 20 mg/kg TF < 50 mg/kg TF > 50 mg/kg TF < 20 mg/kg 10% TF < 50 mg/kg TF > 50 mg/kg Abbildung 1 Prozentuale Verteilung der TF-Befunde in Lebensmittelkontaktmaterialien Um zu untersuchen, ob die festgestellten fluorhaltigen Verbindungen beim Gebrauch der Lebensmittelkontaktmaterialien in Lebensmittel bergehen, wurden an sechs ausgewhlten Proben, in denen vergleichsweise hohe Gehalte an fluorierten Verbindungen nachgewiesen wurden, Migrationsuntersuchungen durchgefhrt. In fnf der sechs untersuchten Migrate wurden AOF-Gehalte unterhalb der Bestimmungsgrenze festgestellt. Fr ein Backfrmchen wurde im wssrigen Migrat ein AOF-Gehalt von 27,8 g/dm2 Kontaktflche festgestellt. Im Rahmen des Projektes ist auch versucht worden die AOF-Gehalte ethanolischer und wssriger Extrakte zu bestimmen. Dabei konnte einerseits keine eindeutige bereinstimmung zwischen den ethanolischen und wssrigen Extrakten festgestellt werden, andererseits unterschieden sich die AOFGehalte deutlich von den TF-Gehalten. Mit Hilfe des TF-Verfahrens konnte der Gesamtgehalt an Fluor in einem niedrigeren Konzentrationsbereich bestimmt werden, als dies mittels AOF-Verfahren mglich war. In diesem Zusammenhang ist auch zu bercksichtigen, dass beim AOF-Verfahren einerseits bei der Extraktion der Proben und andererseits bei der Adsorption der fluorierten Verbindungen aus dem Extrakt an der Aktivkohle Verluste auftreten knnen, die zu Minderbefunden fhren knnen. Aufgrund der vergleichsweise aufwendigen Bearbeitung der Proben, hoher Blindwerte und niedriger Reproduzierbarkeiten der Messungen, wurden die AOF-Untersuchungen von Extrakten nicht weiterverfolgt. Fr die weiteren Untersuchungen des Gesamtfluorgehalts der Lebensmittelkontaktmaterialien wurde daher auf das TF-Verfahren zurckgegriffen. Einzelstoffanalytik Sechs der untersuchten Proben (Papierfrmchen, Muffinfrmchen, Papierfolie, Bambusbecher, Pappteller und Schalen aus Holzschliff) wurden beim SGS Institut Fresenius auf insgesamt 96 PFASEinzelverbindungen untersucht. Insgesamt wurden fr zwlf verschiedene PFAS Positivbefunde festgestellt. Neben klassischen Perfluoralkylcarbonsuren mit einer Kettenlnge von 3 bis 12 fluorierten Kohlenstoffatomen, wurden zwei lngerkettige polyfluorierte Alkylcarbonsure, ein Fluortelomeralkohol (6:2 FTOH) und ein Fluoracrylate (6:2 FTAcr) nachgewiesen (Tabelle 4). Fr die Einzelverbindungen wurden Gehalte bis 740 g/kg (PFBA in einer Salatschale aus Holzschliff) nachgewiesen. Tabelle 4: Positivbefunde der PFAS-Einzelstoffanalytik Parameter Krzel LC-MS/MS Pentafluoropropionic acid Perfluorbutansure Perfluorpentansure Perfluorhexansure Perfluorheptansure Perfluoroctansure Perfluordecansure Perfluordodecansure 3-Perfluoropentyl propanoic acid 2H-Perfluoro-2-octenoic acid GC-MS 2-Perfluorohexyl ethanol 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8Tridecafluorooctyl acrylate BG: Bestimmungsgrenze n.a. : nicht auswertbar, Matrixstrungen * BG wegen Matrixstrungen angehoben Auszug aus dem Prfbericht der Firma SGS Fresenius PFPrA PFBA PFPeA PFHxA PFHpA PFOA PFDA PFDoDA 5:3FTCA FHUEA 6:2 FTOH 6:2 FTAcr Schalen aus CAS BG Holzschliff [g/kg] [g/kg] 422-64-0 (2) 120 375-22-4 2 740 2706-90-3 2 66 307-24-4 2 440 375-85-9 2 13 335-67-1 2 < BG 335-76-2 2 < BG 307-55-1 2 < BG 914637-49-3 4 110 70887-886 2 180 647-42-7 40 120 17527-29-6 25 < BG Papierfrmchen [g/kg] < BG* < BG < BG 10 < BG 3 3 2 < BG 3 60 28 Bambusbecher [g/kg] < BG* < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG MuffinFrmchen [g/kg] < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG Pappteller [g/kg] < BG* < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG PapierMuster [g/kg] < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG < BG 60 100 Toxische Wirkungen Die ermittelten Aktivitten in den In-vitro-Assays werden fr die Heiwasser- und ethanolischen Extrakte auf die extrahierte Flche des Probenmaterials bezogen, fr die Migrationsproben dagegen auf den relativen Anreicherungsfaktor (REF - relative enrichment factor) bzw. auf BioequivalentKonzentrationen, d.h. auf die Konzentration der Positivkontrolle, die eine vergleichbare Aktivitt wie die untersuchte Probe auslst. Basistoxizitt Alle Heiwasser- und ethanolischen Extrakte der untersuchten Kaffeebecher (Probencodes A, D, E und G) zeigten eine hohe Toxizitt im Mikrotox-Assay, mit einer EC50 (Effektkonzentration, die zu einer halbmaximalen Hemmung der Lumineszenz der Bakterien fhrt), die generell bei einer extrahierten Flche zwischen 0,07 und 0,60 cm des Probenmaterials lag. Lediglich fr den Kaffeebecher G ergab sich im Heiwasserextrakt mit 1,35 cm eine leicht geringere Basistoxizitt. Fr die beiden Essenscontainer (Probencodes B und C) und das Papierfrmchen (Probencode F) lagen die ermittelten EC50-Werte mit 0,45 bis 0,64 cm fr die Heiwasserextrakte bzw. 0,14 bis 0,74 cm fr die ethanolischen Extrakte in einem hnlichen Toxizittsbereich. Die bewerteten Ergebnisse fr die Untersuchungen der Extrakte mit den In-vitro-Assays sind in der Abbildung 2 fr die Kaffeebecher und in der Abbildung 3 fr die Essenscontainer und das Papierfrmchen als Heatmap dargestellt. Abbildung 2: Heatmap zur Visualisierung der bewerteten Befunde aus den Extraktionsuntersuchungen mit den Kaffeebechern A, D, E und G mit wssrigem (links) und ethanolischem Medium (rechts). Fehlende basistoxische (Mikrotox-Assay), anti-estrogene (YAES), anti-androgene (YAAS), androgene (YAS), estrogene (YES), dioxinhnliche (YDS) und mutagene Aktivitten (Ames-Test) sind in grn, mige Aktivitten mit statistisch signifikanter Abweichung von der Negativkontrolle in gelb und hohe Aktivitten in rot wiedergegeben. Abbildung 3: Heatmap zur Visualisierung der bewerteten Befunde aus den Extraktionsuntersuchungen mit den Essenscontainern B und C sowie den Papierfrmchen (Muffinfrmchen) F mit wssrigem (jeweils links) und ethanolischem Medium (jeweils rechts). Fehlende basistoxische (Mikrotox-Assay), anti-estrogene (YAES), anti-androgene (YAAS), androgene (YAS), estrogene (YES), dioxin-hnliche (YDS) und mutagene Aktivitten (Ames-Test) sind in grn, mige Aktivitten mit statistisch signifikanter Abweichung von der Negativkontrolle in gelb und hohe Aktivitten in rot wiedergegeben. Bei der Untersuchung der Migrationsproben nach 120-mintiger Versuchsdauer waren diese fr die Kaffeebecher D, E und G ebenso wenig auffllig wie die ethanolische Migrationsprobe des Essenscontainers B: Auch bei einer 90-fachen Anreicherung der Proben wurde keine 50 %ige Hemmung im Mikrotox-Assay erreicht. Dagegen wurde fr den Kaffeebecher A bereits bei einer Anreicherung von 7,0 (wssriges Migrat) bzw. 7,4 (ethanolisches Migrat) eine halbmaximale Hemmung der Biolumineszenz erzielt. Die Migrate der beiden Essenscontainer waren mit EC50-Werten von 11,5 bzw. 39,4 (wssriges Medium) und 36,5 (ethenolisches Medium Probe C) zwar etwas weniger aktiv als der Kaffeebecher A, wiesen aber ebenfalls eine hohe Basistoxizitt nach 120 Minuten auf. Die bewerteten Ergebnisse fr Untersuchungen der Migrate nach 120 Minuten sind in der Abbildung 4 fr die Kaffeebecher und in der Abbildung 5 fr die Essenscontainer als Heatmap dargestellt. Fr die entsprechenden Untersuchungen stand nicht gengend Material der Papierfrmchen (Probe F) zur Verfgung. Abbildung 4: Heatmap zur Visualisierung der bewerteten Befunde aus den Untersuchungen der Migrate nach 120 Minuten mit den Kaffeebechern A, D, E und G mit wssrigem (links) und ethanolischem Medium (rechts; Probe D wurde aufgrund nicht ausreichenden Materials nicht mit ethanolischem Medium getestet). Fehlende basistoxische (Mikrotox-Assay), anti-estrogene (YAES), anti-androgene (YAAS), androgene (YAS), estrogene (YES), dioxin-hnliche (YDS) und mutagene Aktivitten (AmesTest) sind in grn, mige Aktivitten mit statistisch signifikanter Abweichung von der Negativkontrolle in gelb und hohe Aktivitten in rot wiedergegeben. Abbildung 5: Heatmap zur Visualisierung der bewerteten Befunde aus den Untersuchungen der Migrate nach 120 Minuten mit den Essenscontainern B und C mit wssrigem (links) und ethanolischem Medium (rechts). Fehlende basistoxische (Mikrotox-Assay), anti-estrogene (YAES), anti-androgene (YAAS), androgene (YAS), estrogene (YES), dioxin-hnliche (YDS) und mutagene Aktivitten (Ames-Test) sind in grn, mige Aktivitten mit statistisch signifikanter Abweichung von der Negativkontrolle in gelb und hohe Aktivitten in rot wiedergegeben. Fr die Kaffeebecher A und G sowie die beiden Essenscontainer konnte zustzlich der zeitliche Verlauf der Aktivitt in den Migrationsproben untersucht werden. Im Kaffeebecher A war erstmals nach 40 und 60 Minuten eine leichte Zunahme der Basistoxizitt im wssrigen Migrat zu verzeichnen (EC50 mit Anreicherungsfaktor 193 bzw. 195, entspricht 15 % Abweichung vom nicht-toxischen Aktivittslevel), die zum Versuchende nach 120 Minuten stark anstieg (EC50 = 6,98). Im ethanolischen Migrat wurden dagegen bereits nach 5, 10 und 20 Minuten hohe Aktivitten ermittelt (EC50 = 24,2 bis 28,7), whrend nach 40 und 60 Minuten unauffllige Befunde vorlagen, nach 120 Minuten jedoch eine sehr hohe Aktivitt (EC50 = 7,37). Das wssrige Migrat im Kaffeebecher G blieb ber den gesamten Zeitverlauf ohne messbare Aktivitt im Mikrotox-Assay, whrend das ethanolische Migrat bereits nach 5 Minuten, ebenso nach 10 und 20 Minuten hohe Aktivitten zeigte (EC50 = 21,3 bis 26,9), whrend im weiteren Verlauf nach 40, 60 und 120 Minuten keine messbare Aktivitt mehr vorlag. Einen komplexen Zeitverlauf der Aktivitten zeigten auch die beiden Essenscontainer. Das wssrige Migrat im Container B war nach 5 und 10 Minuten noch unauffllig, nach 20, 40 und 60 Minuten nahm die Aktivitt zu und erreichte ein miges Niveau (EC50 = 34,4 bis 52,9), nach 120 Minuten ein sehr hohes Niveau (EC50 = 11,5). Dagegen wurde im ethanolischen Migrat lediglich nach 10 und 60 Minuten eine sehr hohe Aktivitt ermittelt (EC50 = 8,92 bzw. 11,6), nicht jedoch zu den anderen Zeiten. Fr den Essencontainer C war die Aktivitt im wssrigen Migrat ber den gesamten Versuchsverlauf weitgehend konstant und auf einem migen Niveau (EC50 = 31,4 bis 63,7), im ethanolischen Migrat ebenfalls berwiegend auf einem migen Niveau (EC50 = 19,7 bis 36,5), jedoch mit einer deutlichen Abweichung nach 10 (EC50 = 5,62; sehr hohe Aktivitt) und 40 Minuten (keine messbare Aktivitt). Die bewerteten Ergebnisse fr den Zeitverlauf der 120-mintigen Migrationsuntersuchungen sind in Abbildung 6 und Abbildung 7 als Heatmap dargestellt. Abbildung 6: Heatmap zur Visualisierung der bewerteten Befunde aus den Migrationsuntersuchungen (Zeitverlauf ber 120 Minuten) mit den Kaffeebechern A und G mit wssrigem (links) und ethanolischem Medium (rechts). Fehlende basistoxische (Mikrotox-Assay), dioxin-hnliche (YDS) und anti-estrogene Aktivitten (YAES) sind in grn, mige Aktivitten mit statistisch signifikanter Abweichung von der Negativkontrolle in gelb und hohe Aktivitten in rot wiedergegeben. Abbildung 7: Heatmap zur Visualisierung der bewerteten Befunde aus den Migrationsuntersuchungen (Zeitverlauf ber 120 Minuten) mit den Essenscontainern B und C mit wssrigem (links) und ethanolischem Medium (rechts). Fehlende basistoxische (Mikrotox-Assay), dioxin-hnliche (YDS) und estrogene Aktivitten (YES) sind in grn, mige Aktivitten mit statistisch signifikanter Abweichung von der Negativkontrolle in gelb und hohe Aktivitten in rot wiedergegeben. Mutagenitt Die weit berwiegende Zahl der untersuchten Extraktions- und Migrationsproben war in allen vier Ames-Fluktuationstests (Stmme YG1041 und YG1042, jeweils mit und ohne S9-Mix) negativ, zeigte also keine mutagene Aktivitt. Lediglich fr den ethanolischen Extrakt des Kaffeebechers E wurde eine mutagene Wirkung mit dem Stamm YG1042 sowohl mit als auch ohne S9-Mix ermittelt. Fr den Heiwasserextrakt des Essenscontainers B konnte eine mutagene Wirkung mit dem Stamm YG1042 ohne S9 Mix gemessen werden. (vgl. Abbildung 2 und Abbildung 3). Endokrine Aktivitt Alle untersuchten Proben zeigten im Minimum fr eine der vier untersuchten endokrinen Wirkungen ein hohes Aktivittsniveau, wenn die Ergebnisse fr die Extrakte und Migrate zusammengefasst werden, weit berwiegend fr mehrere der untersuchten endokrinen Endpunkte (vgl. Abbildung 2 bis Abbildung 7). So zeigte der Kaffeebecher A eine hohe anti-estrogene, anti-androgene und estrogene Aktivitt, die Becher D und E eine hohe anti-estrogene und anti-androgene Aktivitt sowie der Becher G eine hohe anti-estrogene und androgene Aktivitt, zustzlich eine mige anti-androgene Aktivitt. Auch die beiden Essenscontainer und das Papierfrmchen waren in den Tests auf endokrine Wirkungen aktiv. Der Container B wies eine hohe estrogene sowie mige anti-estrogene und androgene Aktivitt auf, der Container C eine hohe estrogene und androgene Aktivitt und das Papierfrmchen F eine hohe anti-estrogene und androgene Aktivitt sowie eine mige antiandrogene und estrogene Aktivitt. Damit war das Papierfrmchen F die aufflligste Probe, die fr alle vier untersuchten endokrinen Wirkungen positiv getestet wurde. Bei der Untersuchung des Zeitverlaufs der Migration waren die anti-estrogene Aktivitt im HeiwasserMigrat des Kaffeebechers A und die estrogene Aktivitt des Essenscontainers B bereits nach 5 Minuten sehr hoch und blieben auf diesem Niveau bis zum Ende des Versuchs nach 120 Minuten. Dagegen war die anti-estrogene Aktivitt des Bechers G nach 5 Minuten auf einem migen Niveau und blieb auf diesem Niveau bis 60 Minuten nach dem Versuchsbeginn, um erst am Ende des Versuchs nach 120 Minuten ein hohes Niveau zu erreichen. Eine estrogene Aktivitt des Containers C war lediglich nach 120 Minuten im Heiwasser-Migrat auf einem hohen Niveau festzustellen, whrend die Proben nach 5 bis 60 Minuten nicht aktiv waren. Dioxin-hnliche Aktivitt Alle untersuchten Kaffeebecher zeigten mige bis hohe dioxin-hnliche Aktivitten (vgl. Abbildung 2 bis Abbildung 7) in den Extraktions- und/oder Migrationsversuchen. Der Kaffeebecher A wies bei der Extraktion keine dioxin-hnliche Aktivitt auf, bei der Untersuchung der wssrigen und ethanolischen Migrate ergaben sich dagegen sehr hohe Aktivitten von 1,13 bzw. 3,77 g -NaphtoflavonEquivalente (-NF-Eq)/L. Die Kaffeebecher D und G zeigten bei der Extraktion mit heiem Wasser sehr hohe Aktivitten (19,4 bzw. 5,64 g -NF-Eq/cm), der Becher E eine mige Aktivitt (1,83 g -NFEq/cm). Wurde das Bechermaterial mit Ethanol extrahiert, stieg die Aktivitt im Falle des Bechers D um mehr als Faktor 6 gegenber der Heiwasser-Extraktion auf 123 g -NF-Eq/cm. Die ethanolischen Migrate der Becher E und G wiesen zwar geringere dioxin-hnliche Aktivitten als der Becher A auf, diese waren beim Becher E aber noch hoch (0,36 g -NF-Eq/L), beim Becher G mig (0,27 g -NFEq/L). Auch alle untersuchten Essenscontainer und das Papierfrmchen wiesen dioxin-hnliche Aktivitten auf, die bei der ethanolischen Extraktion maximal 48,4 bzw. 60,4 g -NF-Eq/cm bei den Proben B und C und 3,35 g -NF-Eq/cm beim Papierfrmchen F erreichten. Fr die beiden Essenscontainer B und C reichte das Material aus, um auch Migrationsproben zu untersuchen. Sowohl bei der Migration in Heiwasser als auch bei der Migration in Ethanol wurden sehr hohe Aktivittsniveaus von bis zu 1,08 g -NF-Eq/L beim Container B und 1,35 g -NF-Eq/L beim Container C erreicht. Bei der Untersuchung des Zeitverlaufs der Migration lag fr beide Essenscontainer bereits nach 5 Minuten grundstzlich eine mige dioxin-hnliche Aktivitt in den wssrigen und ethanolischen Migraten vor, wobei jeweils nach 120 Minuten die hchste Aktivitt ermittelt wurde. PFAS spezifische TTR-disruptive Aktivitt Der TTR-TR-CALUX wurde zustzlich zu den oben beschriebenen in vitro-basierten Verfahren mit ausgewhlten ethanolischen Migraten durchgefhrt, um einen spezifischen Biotest fr die Detektion von PFAS oder strukturell hnlichen Substanzen zu integrieren. Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass die ethanolischen Migrate aller Lebensmittelkontaktmaterialien eine Grundaktivitt im TTR-TR CALUX aufwiesen. Dies wird durch die etablierten Konzentrations-Wirkungskurven ersichtlich (siehe Abbildung 8). Hierbei ist zu beachten, dass die beobachteten Aktivitten ausschlielich auf die Lebensmittelkontaktmaterialien und nicht auf das Lsungsmittel oder die Prozessierung der Proben zurckzufhren sind, da die Kontrolle keinerlei Aktivitt im getesteten Konzentrationsbereichs des TTR-TR CALUX aufwies (vgl. Abbildung 9). TTR-TR CALUX all samples relative induction 120 100 80 60 40 20 0 -4 -3 -2 -1 0 log (1/dilution) A B E G PFOA Standard Abbildung 8: Relative Aktivitt des humanen TR in U2OS Zellen innerhalb des TTR-TR-CALUX Tests nach Exposition mit ethanolischen Migraten ausgewhlter Lebensmittelkontaktmaterialen. Symbole und Fehlerbalken zeigen die mittlere relative Lumineszenz mit Standardabweichung von 3 unabhngigen biologischen Replikaten fr die Probenmaterialien Kaffeebecher (A, E, G) und Ess-Schalen (B) sowie der PFAS-Referenzsubstanz PFOA. Die Konzentrations-Wirkungskurven wurden mittels einer 4-Parameter nicht-linearer Regression (Bottom und Top fixiert auf 0, 100) an die Datenpunkte gefittet. relative induction 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -4 -3 -2 -1 0 log (1/dilution) PFOA Standard EtOH control Abbildung 9: Relative Aktivitt des humanen TR in U2OS Zellen innerhalb des TTR-TR-CALUX Tests nach Exposition mit ethanolischer Kontrolle (EtOH control). Symbole und Fehlerbalken zeigen die mittlere relative Lumineszenz mit Standardabweichung von 3 technischen Replikaten fr die EtOH-Kontrolle sowie der PFAS-Referenzsubstanz PFOA. Die Konzentrations-Wirkungskurven wurden mittels einer 4-Parameter nicht-linearer Regression (Bottom und Top fixiert auf 0, 100) an die Datenpunkte gefittet. Bei einem Vergleich der einzelnen Kontaktmaterialien miteinander zeigten sich deutliche Unterschiede der toxischen Wirkung. Probe A (Kaffeebecher) wies die strkste spezifische Aktivitt (125 g PFOA eq./L) auf und deutete damit auf die hchste Konzentration von PFAS oder strukturell hnlichen Komponenten im Migrat hin (vgl. Tabelle 5). Whrend die restlichen Proben B, E und G im Konzentrationsbereich REF 1.95 -1000 untersucht werden konnten, musste Probe A fr eine Quantifizierung 4-fach verdnnt untersucht werden, sodass sich ein untersuchter Konzentrationsbereich von REF 0,49 - 250 ergab. Die Proben B (Ess-Schale) und E (Kaffeebecher) wiesen mit ca. 80 g PFOA eq./L, gefolgt von Probe G mit 35 g PFOA eq/L) eine deutlich geringere Aktivitt auf (Tabelle 5). Tabelle 5 Spezifische Aktivitt der Lebensmittelkontaktmaterialien im TTR-TR-CALUX. Die spezifische Aktivitt wurde basierend auf dem PC80 der Proben sowie des PFOA-Standards berechnet (siehe Abbildung 8). Lebensmittelkontaktmaterialien A (Kaffeebecher) B (Ess-Schale) E (Kaffeebecher) G (Kaffeebecher) Spezifische Aktivitt / (g PFOA eq. / L sample) 124,96 80,06 80,56 34,71 Bei einem Vergleich der bioanalytischen Hinweise auf PFAS-Belastungen mit den chemisch bestimmten Parametern Gesamtfluor (TF) und adsorbierbare Fluorverbindungen (AOF) ist festzustellen, dass der Trend von steigende FT/AOF Gehalte mit dem Trend strkerer TTRBindungsaffinitt von Probe G ber E hin zu B und A korreliert. Dennoch weist die Ess-Schale B einen hheren TF/AOF Gehalt als Kaffeebecher A auf, was im bioanalytischen Ranking vertauscht ist. Diese Unterschiede geben erste Hinweise darauf, dass eine rein chemische Bestimmung von PFAS nicht ausreicht, um die thyroid-disruptive Aktivitt der Proben beurteilen zu knnen; bioanalytische Verfahren sollten zustzlich angewandt werden, da eine komplexe Mischung verschiedenster Kontaminanten, einschlielich verschiedener PFAS-Substanzen, eine abweichende toxische Wirkung von den zu erwartenden Einzelstoffen haben kann. Zudem ist zu beachten, dass durch die hier angewandte Probenprozessierung auch andere Komponenten der Migrate neben fluorierten Substanzen eine TTR-Bindung und damit einen Nachweis im TTR-TR CALUX ausgelst haben knnten. Die Beobachtung, dass alle ausgewhlten und untersuchten Lebensmittelkontaktmaterialien eine Thyroidhormon-beeintrchtigende Wirkung aufweisen, fgt sich in die bekannte Aktivitt anderer Lebensmittelkontaktmaterialien ein. In einer internationalen Vergleichsstudie wurden in 11 von 17 untersuchten Lebensmittelkontaktmaterialien (65%) im gleichen bioanalytischen Verfahren (TTr TR CALUX) signifikante TTR-disruptive Aktivitten nachgewiesen11. Hier waren vor allem Produkte aus Deutschland auffllig. Ausblick Die wissenschaftlichen Untersuchungen werden fortgesetzt; es ist geplant die Extrakte mittels Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) zu untersuchen und ein weiterfhrendes Screening auf PFAS-Einzelsubstanzen durchzufhren. Zudem sind weitere Untersuchungen der biologischen Aktivitt vorgesehen. Zu gegebener Zeit ist auch eine wissenschaftliche Publikation der Ergebnisse geplant. 11 Strakov, J., Schneider, J., Cingotti, N. et al., 2021. Throwaway Packaging, Forever Chemicals: European wide survey of PFAS in disposable food packaging and tableware. 54 p.