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Study Sponsor: Issue Date: Document Reference No.: ELF ATOCHEM 15 -M ar-95 258250 AR226-3011 Bacteria Growth Inhibition Author(s): H. Thiebaud Coll. A.M. Petit English Translation of Report Sum m ary for DuPont Chemical Solutions Enterprise 27-Jan-03 Company Sanitized. Does not contain TSCA CBf ELF ATOCHEM Levallois Applications Center TECHNICAL SUMMARY Determination of growth inhibition of Pseudomonas putida bacteria b y f l H m B B was eif ,, f d using the operating procedure described in proposed standard ISO/DIS i u n z (ct. aoc 11 o fn o r T90B). The method consists in exposing the bacteria for 16 hours to a range of concentrations of the substance being studied. The inhibiting effect observed on Pseudomonas putida is determined by comparing the ceil growth at various dilutions of the substance with the ceil growth obtained for a culture under the same conditions but which does not contain the test substance. The cell growth is determined by turbidimetry using a spectrophotometer. The percent cell growth inhibition H is given by the relation : H = ((Bk - Bn)/(Bk - B0))x100 where Bk and Bn are the turbidities, respectively, in the control and test flasks (after deduction of noninoculated whites) and BO is the turbidity at t = 0 in the control flasks. Under the test conditions. iresents a : CES0- 1 6 h = 28 mg/i, with a confidence interval at 95 % = 16 - 41 mg/l and a CE10- 1 6 h = 1.2 mg/l, with a confidence interval at 95 % = 0.12 - 3.6 mg/l The reference substance, 3,5-dichlorophenol, has a CE50 - 1 6 h equal to 17 mg/l and a C Ei0 - 1 6 h equal to 9.1 mg/l The validity criteria mentioning that the inoculum used in the control grew by at least a factor of 60X for the duration of the test was respected (growth factor = 1 0 4 ). A. M. PETIT H. THIEBAUD Company -of contain i ELF ATOCHEM D .C .R .D . Centre d'Application de Levaliois Service Analyse Environnem ent Levaliois le : 1 5/0 3/95 Rf. document : 2 5 8 2 5 0 N de Squentiel : 814 02 0 TITR E : D TER M IN A TIO N DE L'IN H IB ITIO N D E LA CRO ISSANCE DES BACTRIES PSEU D O M O N AS PUTIDA A U T E U R (S ) : H. THIBAUD Coil. A.M. P E T IT RESUME D O C U M ENTA IR E : n p tp rminatinn de l'inhibition de la croissance des bactries P s eu d o m o n as putida par suivant le mode opratoire dcrit dans la m thode du p r o j e t S n f f l e l s O / D I S 1 0 7 1 2 (cf. doc 118 A fn o rT 9 0 B). nhibition de la croissance des bactries P seudom onas putida] DESTINATAIRE : M. D EVAU X (DCFS) Ce rapport comprend 3 pages et N feuillets non pagins (feuilles de saisie, de calcul et reprsentation graphique) Copies : C hef de Service, Responsable des Archives, Laboratoire d'cotoxicologie (copie coll.) Secrtariat, Fichier TEC H Service cotoxicit et Sret des Produits (D S EP ) Ce document est ia proprit d'ELF A TO C H EM . Il ne peut tre ni copi, ni communiqu des tiers sans autonsation formelle. La reproduction de ce rapport d'tude n'est autorise que sous forme de fac-simil photographique intgral. ^ REPS3890.DOC Page 1/3 eofiP8^ a ` cWtai<*tSCAC3' ELF ATOCHEM Centre d'Application de Levallois RSUM TEC H N IQ U E La dterm ination^jaJltliibition de la croissance des bactries Pseudom onas putida par t ralise en suivant le mode opratoire d crit dans le p ro je td ^ T o rm ^ S O /D IS i 1 0 7 1 2 (cf. doc 118 A fnr T 9 0 B). La mthode consiste exposer pendant 16 heures les bactries une gamme de concentrations de la substance tudie. L'effet inhibiteur sur Pseudom onas putida est dtermin p ar com paraison de la croissance cellulaire des diverses dilutions de substance avec la croissance cellulaire obtenue pour une culture ralise dans les mmes conditions m ais ne contenant pas de substance d'essai. La croissance des bactries est m esure par turbidimtrie avec un spectrophotomtre. Le pourcentage d'inhibition d e la multiplication cellulaire, H, est donn p ar : H = ((B k-B n )/(B k-B 0))x100 . avec Bk et Bn, les turbidits respectivement dans les flacons tm oins e t dans les flacons d'essai (aprs dduction des blancs non inoculs) et B0, la turbidit t = 0 dans les flacons tm oins. Dans les conditions de l'tude, l e ^ H V i ^ H B ^ p r s e n t e une : C E 5o-1 Sh = 2 8 m g /l, a v e c un intervalle de confiance 95 % g al 16 - 41 mg/l, et une C E 10-16 b = 1 ,2 m g /l, ave c un intervalle de confiance 95 % g al 0 ,1 2 - 3,6 mg/l. La substance de rfrence, le 3,5-dichlorophnol, prsente une CE so-16h gale 17 mg/l et une C E 10-1 6 h g a le 9,1 mg/l. * Le critre de validit m entionnant que l'inoculum utilis dans le tm oin s'est multipli par au moins un facteu r 6 0 pendant la dure de l'essai a t respect (facteur de croissance = 104). Ce document est la proprit d'ELF A TO C H EM . Il ne peut tre ni copi, ni communiqu des tiers sans autorisation formelle. La reproduction de ce rapport d'tude n'est autorise que sous forme de fac-simil photographique intgral. c$ l t REPS3890.DOC Page 2/3 CBl f l. --- ELFATOCHEM Centre d'Application de Levallois ESSSAI D'INHIBITION DE LA CROISSANCE DE PSEUDOMONAS PUTIDA mthode dcrite dans le projet de norme IS O /D IS 10712, cf doc 118 A fnor T30 8 j Substance tudie Nom| Rfrence CAL : 3890/94 Substance de rfrence Nom : 3-5 DICHLOROPHENOL Rfrence CAL (lot) : ALDRICH 97% 633 Demandeur de l'tude : Directeur de l'tude : Ralisation technique : Date du dbut de l'essai : Date de la rdaction du rapport d'tude : M. DEVAUX (DCFS) H. THIEBAUD A.M. PETIT 26/12/94 15/03/95 Prparation de l'chantillon : Le jour de l'essai, une solution mre 500mg/l dans l'eau ultra-pure est prpare. Mesures des oH : Concentration Omamisme test : 0mg/l 200 mg/l pH en dbut d'essai 6,97 7,08 pH en fin d'essai 4,65 4,54 Pseudomonas putida ; Institut PASTEUR 103281 Matriel : Verrerie strilise (Erlens de 50ml) Spectrophotomtre Perkin -Elmer lambda 5 Agitateur thermostat 21 C +/-1 C Gamme de concentrations : V o lu m e (m ) Solution mre ou solution mre dilue de la 4 2 1 0,5 0,25 substance (facteur de dilution entre parenthses) Eau Milieu d'essai Inoculum 4 6 7 7,5 7,75 11 111 11 111 Concentration (mg/l) 200 100 50 25 12,5 0 8 1 1 0 Ce document est la proprit d'ELF A TO C H EM . Il ne peut tre ni copi, ni communiqu des tiers sans autorisation formelle. La reproduction de ce rapport d'tude n'est autorise que sous forme de fac-simil photographique intgral REPS3890.DOC Page 3/3 ..(,.7g. ^ S a r,ia ` 1 f Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h - Mthode dcrite dans le projet de norme IS O /D IS 10712 Feuille de saisie des mesurages Substance tudie : Nom : Rf. CAL : 3890/94 Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Turbidit de la prculture nombre de mesure absorbance (A436) 1 2 3 moyenne #DIV/0! FNU #N/A #N/A #N/A #DIV/0! Inoculum dans le tmoin Concentration initiale (% vol) : Turbidit initiale BO (A 436) : Facteur de croissance observ pendant la dure de l'essai : 10% 5,1 104 Concentration Mesuraae de l'absorbance (A436 ) en fin d'essai dans les sries d'essai et le tmoin (mg/l) 0 (tmoin) 12,5 facteur de dilution 0,05 0,20 Essais 1 0,112 0,288 2 0,100 0,293 3 0,098 0,238 4 0,103 5 0,094 6 25 0,25 0,257 0,255 0,244 50 0,33 0,315 0,239 0,279 100 0,50 0,279 0,258 0,290 200 1,00 0,510 0,418 0,566 "P DO3 ao1 5 ^ - CB* 2 r Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h - Mthode dcrite dans le projet de norme ISO /D IS 10712 Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la mthode des Probits Substance tudie ; Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Concentration Absorbance (mg/l) moyenne (A436moy) 0 (tmoin) 0,101 12,5 0,273 25 0,252 50 0,278 100 0,276 200 0,498 #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A Turbidit moyenne (FNU moy) 530 350 260 220 140 130 N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 34,3 51,4 59,1 74,3 76,2 #N/A #N/A #N/A CESO = CE50 > CE50 < CE1Q = CE10 > CE10 < r2 = 28 16 41 1,2 0,12 3,6 0,958 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l ; valeur non disponible. Donnes utilises pour le calcul (excluant le binme 0;0 du tmoin) Concentration Inhibition PROBIT log conc. (mg/l) (%) corrige y X (%) 12,5 34,3 34,3 4,590 1,097 25 51,4 51,4 5,030 1,398 50 59,1 59,1 5,230 1,699 100 74,3 *74,3 5,640 2,000 " 200 76,2 76,2 5,710 2,301 #N/A N/A NOMBRE! #N/A #N/A NOMBRE! #N/A N/A NOMBRE! #N/A #N/A NOMBRE! nb valeurs Somme 26,200 8,495 5I Moyenne 5,240 1,699 - n A c0t fS C 3 Probit de la proportion inhibe en fonction du logarithme dcimal de la concentration h Valeurs exprimentales Droite calcule 6,000 5,500 5,000 4,500 4,000 3,500 3,000 2,500 2,000 1,500 0,000 0,500 1,000 1,500 Logarithm e dcim al de la concentration 2,000 1,000 2,500 Probil de lo proportion inhibe >lco v ^ l S 1 Essa d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h - Mthode dcrite dans le projet de norme IS O /D IS 10712 y Feuille de saisie des mesurages Substance tudie : Nom : 3-5 DICHLOROPHENOL Rf. CAL : Rfrence Aldrich Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Turbidit de la prcuiture nombre de absorbance mesure (A436) 1 2 3 moyenne #DIV/0! FNU #N/A #N/A #N/A #DIV/0! inoculum dans le tmoin Concentration initiale (% vol) : Turbidit initiale B0 (A 436) : Facteur de croissance observ pendant la dure de l'essai : 10% 5,1 104 Concentration Mesurage de l'absorbance (A436 ) en fin d'essai dans les sries dressai et le tmoin (mg/l) 0 (tmoin) facteur de dilution 0,05 Essais 1 0,112 2 0,100 3 0,098 4 0,103 5 0,094 6 10 0,25 0,449 0,405 0,436 15 0,25 0,316 0,324 0,342 20 0,25 0,249 0,243 0,281 25 1,00 0,315 0,396 0,307 30 1,00 0,060 0,028 0,720 RPSE2612.XLS O H - S' 1S 2 Essai d'inhibition de la croissance de Pseudomonas putida - Essai dfinitif, 16 h - Mthode dcrite dans le projet de norme IS O /D IS 10712 3 Feuille de calcul des pourcentages d'inhibition et des concentrations efficaces par la mthode des Probits Substance tudie : Nom : 3-5 DICHLOROPHENOL Rf. CAL : Rfrence Aldrich Souche de Pseudomonas putida : Institut Pasteur 103281 Concentration (mg/l) 0 (tmoin) 10 15 20 25 30 #N/A #N/A #N/A Absorbance moyenne (A436moy) 0,101 0,430 0,327 0,258 0,339 0,269 #N/A #N/A #N/A Turbidit moyenne (FNU moy) 530 440 340 270 87 69 #N/A #N/A #N/A Inhibition (%) 0,0 17,1 36,2 49,5 84,4 87,8 #N/A #N/A #N/A CE50 = CE50 > CE50 < CE10 = CE10 > CE10 < r2 = 17 14 21 9,1 4,6 12 0,939 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l #N/A : valeur non disponible. | #NOMBRE! : valeur indtermine. Donnes utilises pour le calcul (excluant le binme 0;0 du tmoin) Concentration Inhibition PROBIT log conc. (mg/l) (%) corrige y X (%) 10 17,1 17,1 4,050 1,000 15 36,2 36,2 4,640 1,176 20 49,5 49,5 4,970 1,301 25 .84,4 84,4 5,990 1,398 30 87,8 87,8 6,130 1,477 #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A #NOMBRE! #N/A #N/A NOMBRE! #N/A #N/A NOMBRE! nb valeurs Somme 25,780 6,352 5 Moyenne 5,156 1,270 RPSE2612.XLS os raC 3 iVled' V tS c ^ G' p i*1 3 Probit de la proportion inhibe en fonction du logarithme dcimal de la concentration - - 3,000 - - 2,000 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 Logarithm e dcimal de la concentration 1,400 1,000 1,600 RPSE2612.XLS