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Unabhngige pharmazeutische Zeitschrift fr Wissenschaft und Praxis Sonderdruck aus Heft 22 112. Jahrgang 1972 Seiten 838-841 Deutscher Apotheker-Verlag Stuttgart Aflatoxine als Gefahrenquelle fr Infusionslsungen Von Oberpharmazierat Dr. Peter Frank Aus der Apotheke der Klinischen Universitts-Anstalten Wrz brg (Direktor: Dr. F. Kochel) lm Anschlu an einen Vortrag, den ich auf der Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Deutscher Krankenhausapotheker der Gruppe Sd 1970 in Bad Drkheim hielt (9), wurde ber die mgliche Anwesenheit von Aflatoxinen in bestimmten Infu sionslsungen diskutiert. Anla war ein Zwischenfall in einer Universitts-Kinderklinik, bei dem nach intravenser Anwen dung eines xylithaltigen Industrieprparates 3 Kinder durch akute gelbe Leberdystrophie ad~exTtm gekommen sein sollen (3). Da zuvor Coats in Australien 1969/70 nach Verabreichung von Xylitinfusionen, die mit Aflatoxinen kontaminiert waren, mehrere Todesflle beobachtet hatte, vermuteten die Kliniker hier gleichfalls ein'e Verunreinigung mit Aflatoxinen. Obwohl dieser Vorfall nicht eindeutig auf die Anwesenheit von Aflato xinen zurckgefhrt werden konnte, kam Xylit als Grundstoff fr Infusionslsungen vorbergehend etwas in Mikredit. Bei feuchtwarmer Lagerung von Grundstoffen fr Infusions lsungen, die fr Mikroorganismen einen guten Nhrboden dar stellen, mu nicht nur bei Xylit, sondern auch bei anderen Kohlenhydraten und Aminosuren mit einem Verderb gerech net werden, insbesondere wenn die Substanzen von Schimmel pilzen befallen sind. Bei der Herstellung von Infusionslsungen ist deshalb nicht nur auf eine Keim- und Pyrogenfreiheit zu achten, sondern auch auf eine Abwesenheit von Aflatoxinen in den sterilisierten Lsungen. Aflatoxine sind Stoffwechselprodukte bestimmter Schimmelpil ze, deren Hauptlieferant Aspergillus flavus Link ist (daher die Bezeichnung Aflatoxin). Die Aflatoxine finden sich im Myzel und in den Sporen des Pilzes oder werden als Exotoxine, in das den Pilz umgebenden Nhrmedium abgeschieden. Diese Mycotoxine werden auch von anderen Aspergillus-Spe zies und sogar von gewissen Penicillium-Arten, z. B. Penicillium isjandicum, -- glaucum sowie von Mucor, unter gnstigen Be dingungen gebildet. Aspergillus flavus kommt als Schimmelpilz ubiquitr vor und befllt vor allem Nahrungs- und Futtermittel. Da der Pilz besonders in feuchtwarmem Milieu gedeiht, sind letztere aus subtropischen und tropischen Lndern oft mit Afla toxinen verseucht. Wegen Lebensmittelknappheit hat allerdings die FAO und WHO in bestimmten Entwicklungslndern ein Limit des Aflatoxingehaltes von 30 ug pro kg Lebensmittel zugeTassen Es mu hervorgehoben werden, da nicht jeder Aspergillus Stamm befhigt ist Aflatoxine zu bilden. In der Gattung Asper gillus gibt es ganz harmlose Vertreter. Die Aflatoxinbildung geht auch nicht parallel mit dem Pilzwachstum einher, sie hngt ab von der Wachstumstemperatur (Optimum liegt bei 30 C), der relativen Feuchtigkeit (gnstig 65 %) und wird unter sttzt durch Substrate wie Glucose, Fructose, Mannit, Amino suren, Vitamin Bi u. a. . Toxische Wirkung der Aflatoxine auf Tier und Mensch Schon lange bestand die Vermutung, da Schimmelpilze (hnlich wie Claviceps purpurea) Toxine bilden. 1893 berichte te Robertsen (zit. 2) von der akuten Erkrankung einer ganzen Familie nach Genu von verschimmeltem Brot. Spter sind ver einzelt Vergiftungsflle bei Tieren bekanntgeworden, die ver schimmeltes Futter erhalten hatten. Als 1960 ber 100 000 Truthhner und Enten in Grobritan nien verendeten, war die Ursache dieser mysterisen Erkran kung (Turkey-X-Disease), die pltzlich auftrat und bei den Tie ren einen Leberschaden auslste, in der Verftterung von ver schimmeltem brasilianischem Erdnumehl zu sehen. Nach intensiver wissenschaftlicher Forschung gelang 1962 die Kristallisation des Aflatoxins (zit. 11), so da nun die Wirkung deiTToxins nachweisbar war. Aflatoxine werden im allgemeinen mit der Nahrung aufge nommen, durch die Darmepithelien resorbiert und auf dem Blutweg vermutlich organspezifisch in Leber, Nieren, Gallen gngen und im Nervensystem lokalisiert. Die dadurch entsteliencferTSchden fhren zu Nieren- und Lebernekrosen, zur Pro liferation der Gallengnge, zu Fibrosen, Lebertumoren und Hmorrhagien im Verdauungstrakt. Sehr empfindlich auf Afla toxine reagieren Enten, Truthhner, Forellen, Kaninchen, Fasa ne, Hhner, Schweine, Affen, Hamster, Hunde und Ratten, whrend Khe und Schafe ziemlich widerstandsfhig sind. Letzteres wird auf den mehrhhligen Magen bei Wiederkuern zurckgefhrt, in dem die Aflatoxine vermutlich abgebaut wer den. Bei der Ratte jedoch fhren schon 10 ug tglich zum Lebercarcinom, eine Dosis, die im Vergleich zu anderen Lebercarcinogenen sehr niedrig ist. Fr eine akute oder chronische Vergiftung des Menschen mit Aflatoxinen liegen konkret noch keine wissenschaftlichen Be weise vor (2, 11). Allerdings ist auf Grund verschiedener Beob achtungen und Erfahrungen im Tierversuch anzunehmen, da Aflatoxine auch fr den Menschen schdlich sind. Verschiedene Lebensmittelvergiftungen sprechen fr diese Annahme. 1968 starben in West-Java 60 Menschen nach dem Genu eines verschimmelten Erdnuproduktes (zit. 10). In Britisch-Guavana werden von den Eingeborenen unliebsame Ein dringlinge mit einem Gifttrank beseitigt, der aus aflatoxinhalti gen Erdnukernen bereitet wird (14). Das gehufte Auftreten von sophagus-Carcinomen bei einem Negerstamm in Sdafri ka ist dem Trinken von aflatoxinhaltigem_Bier zuzuschreiben (zit. 2). Der erste Fall einer Aflatoxikose in der Bundesrepublik ist wahrscheinlich bei einem innerhalb kurzer Zeit verstorbenen Mann aufgetreten, bei dem der Mnsteraner Pathologe Morgen roth eine akute gelbe Leberdystrophie diagnostizierte. Der Pa tient hatte an einer Eisenspeicherkrankheit gelitten, die in eine Lebercirrhose berging. Da aber die Grundkrankheit noch nicht so fortgeschritten war, konnte man den raschen Tod nur damit erklren, da der Kranke die Gewohnheit hatte, unge whnlich _groe Mengen verschimmelter (wie sich nachtrglich herausstellte mycotoxinhaltiger) Nukerne zu essen. Aus der Leber des Verstorbenen lieen sich blaufluoreszierende Sub stanzen isolieren, die spcktralanalytisch auf Aflatoxine hinwie sen (zit. 11). Experimentell konnte eine Empfindlichkeit von Aflatoxinen auf menschliche Zellen nachgewiesen werden. Zuckermann (22, 23) stellte eine schdigende Wirkung auf embryonales Lungen- gewebe und auf die in Kultur gehaltenen menschlichen Leber zellen fest. Bei gesunden Menschen sind fr eine manifeste Strung un ter Bercksichtigung der aus Tierversuchen gewonnenen Ergeb nisse sicher so groe Aflatoxinmengen notwendig, wie sie wahr scheinlich nur in Ausnahmefllen mit der Nahrung aufgenom men werden (11). Eine wesentlich strkere Giftwirkung erfolgt jedoch bei Patienten mit bereits vorhandenem Leberschaden, weil die Entgiftungsleistung der Leber gestrt ist. Bedeutung der Aflatoxine in der Lebensmittelchemie Die Untersuchung auf Aflatoxine spielt in der Lebensmittel chemie, insbesondere bei der Lebensmittelberwachung seit einigen Jahren eine zunehmende Rolle. Aflatoxine wurden nachgewiesen im Brot, lhaltigen Samenkernen (vor allem in Erdnssen), Sojabohnen, Getreide, Reis, Mais, Erbsen, Obst (z. B. auch in den Schalen von Zitrusfrchten) Gemse, Kakao bohnen, Fruchtsften und als Spuren im Wein (17). In spontan verschimmelten Lebensmitteln wies Hanssen zwar nur in etwa 10 % der Flle Aflatoxine nach, Wurst- und Fleisch waren aflatoxinarm. Bei spontan verschimmelter Marme lade konnte kein Aflatoxin gefunden werden, was vermutlich auf den hohen Zuckergehalt zurckzufhren ist, der infolge sei ner osmotischen Wirkung ein Auskeimen der Sporen sowie die Aflatoxinbildung verhindert (11). ' Technologische Verfahren zum Abba der thermoresiStenten Aflatoxine aus Lebensmitteln, wie z. B. auf biologischem Wege mit Hilfe des Flavobacteriums aurantiacum, das befhigt ist, Aflatoxine in ungiftige Stoffwechselprodukte berzufhren, ha ben bisher kaum praktische Bedeutung erlangt. Man ist gezwun gen durch hygienische Manahmen bei der Ernte, bei der Weiterverarbeitung und Lagerung von Lebensmitteln einen Pilzbefall auszuschlieen. Auch wird versucht durch Konservie rung (z. B. erlaubter Zusatz von Sorbinsure zu Brot (20)) das Schimmelwachstum in den verarbeiteten Nahrungsmitteln zu unterdrcken. Chemie, Eigenschaften und Nachweis der Aflatoxine Aflatoxine besitzen ein Difurano-Cumarin-Grundgerst. Die wichtigsten Vertreter sind die Aflatoxine Bt und Gj, mit den Dihydroverbindungen B2 und G2. . Die Buchstaben B und G weisen auf die blaue bzw. grne Fluoreszenz im UV-Licht hin. Die Indices bedeuten die Reihen folge im Chromatogramm entgegen der Laufrichtung (von oben nach unten gerechnet). Weitere Aflatoxin-Derivate, die meist Umwandlungsprodukte der vorgenannten darstellen, werden mit Mi und M2 bzw. B2a und G2a bezeichnet. - Das Molekulargewicht der Aflatoxine liegt zwischen 312 und 330 und ist relativ klein. Die Toxine schmelzen unter Zerset zung zwischen 190 und 310 C. Die Aflatoxine sind optisch ak tiv. Im Ultraviolett-Bereich zeigen sie charakteristische Absorp tionskurven und fluoreszieren bei 360 nm. Die Absorptionsmaxima liegen bei den strukturell bekannten Aflatoxinen bei 265 nm und 362 nm (2). Auf Grund der chemischen Struklur, ins besondere wegen des Difurano-Cumarin-Gerstes und des Vor handenseins eines Lactonringes sind Aflatoxine durch uere Einflsse leicht vernderlich. Aflatoxine sind lichtgeschtzt aufzubewahren, da sie durch ln gere Einwirkung des Tages- bzw. UV-Lichtes eine rasche Vern derung (teilweise Umwandlung in neue Derivate) erfahren, be sonders wenn sie in Lsung sind. Die in Chloroform gelsten Aflatoxine sind etwas stabiler als die in wsserigen und metha- nolischen Lsungen. . Auch Luft und Sauerstoff sowie verdnnte Laugen und Su ren (NaOH, KOH, HCl, H2S 0 4) verwandeln Aflatoxine in neue Derivate. Unschdlich gemacht werden Aflatoxine durch lOmintiges Einlegen in Natriumhypochloritlsung. Dies spielt eine Rolle beim Arbeiten mit Aflatoxinen, wo die benutzten Gerte anschlieend zur Entgiftung mit Natriumhypochloritl sung oder mit Chromschwefelsure gereinigt werden. Die erwhnte Instabilitt der Aflatoxine, die trotz ihrer Ver nderlichkeit hochpotent giftig sind, erschwert die Identifizie rung. Der biologische Nachweis durch direkte Verftterung der Untersuchungsprobe an Ratten ist nicht zuverlssig, weil die in den Nahrungsmitteln vorhandenen geringen Mengen erst ange reichert werden mssen und deshalb nur Langzeitversuche zu einem brauchbaren Ergebnis fhren. Die Versuchszeiten fr die Entwicklung von Tumoren betragen Monate. Andere biologi sche Verfahren mit Entenkken sowie mit Enten- und Hhner bruteiern (Hhnerembryonen) bergen viele Unsicherheitsfakto ren in sich, so da zumindest fr Routineuntersuchungen derar tige biologische Nachweisverfahren weniger geeignet sind (2). Der^Nachweis von Aflatoxinen wird heutzutage durchweg mit tels Dnnschichtchromatographie und UV-Absorptions-Spektrophotometrie durchgefhrt. Eine Trennung der Aflatoxine Bt, B2, Gt und G2 ist auf Kieselgelplatten zweidimensional mit Chloroform-Methanol (97:3) bzw. Chloroform-Aceton (90:10) mglich. Bei der Chromatographie wird keine exakte Reproduzierbar keit der Rf-Werte angestrebt, weil die in den Rohextrakten ent haltenen Begleitsubstanzen die Laufstrecke beeinflussen. Es be whrt sich deshalb, einen sog. internen und externen Aflatoxin Standard mitlaufen zu lassen (der interne Standard enthlt die Untersuchungsprobe gemischt mit dem Vergleichsaflatoxin, whrend der externe Standard nur Vergleichsaflatoxin dar stellt). Bei der chromatographischen Untersuchung von Lebensmit teln knnen im Bereich der vermuteten Aflatoxine blau- oder grnlich fluoreszierende Flecke auftreten, die nicht mit Aflato xinen identisch sind (5). Bei solchen Lebensmitteluntersuchun gen mu das Ergebnis durch Chromatographie mit verschiede nen Fliemitteln oder spektralanalytisch abgesichert werden. hnliche Fluoreszenzen wurden bei der Untersuchung von lnfusionslsungen nicht beobachtet. Zur Unterscheidung der Rf-hnlichen Verbindungen von Aflatoxinen eignet sich nach Mcke und Kiermeier (15) eine Farbreaktion, bei der eine Diazotierung der Aflatoxine im alka lischen Milieu mit Echtblausalz B vorgenommen wird. Hierbei werden die Aflatoxine Bi und Bo violett, die Aflatoxine Gj und G2 braun gefrbt. Die genannte Frbung gelingt besonders gut auf Kieselgelplatten der Firma Woelm, whrend auf ande ren Fertigplatten wegen gewisser Bindemittel sich mitunter eine Strende Verfrbung der Kieselgelschicht ergeben kann. Mit der Dnnschichtchromatographie ist nicht nur ein quali tativer Nachweis der Aflatoxine durchfhrbar, sondern auch eine halbquantitative Bestimmung (die allerdings gewisse Erfah rung und bung voraussetzt) ist mglich, da die Strke der Fluoreszenz einer fluoreszierenden Substanz stets proportional der Substanzmenge ist. Hierbei werden visuell die fluoreszie renden Flecke mit Standards verschiedener Konzentrationen verglichen (Ablesefehler 20--30 %). Der sicherste Beweis fr das Vorhandensein von Aflatoxinen ist durch die Aufnahme eines UV-Absorptions-Spektrums gegeben. Da bei 362 nm eine lineare Abhngigkeit der Extinktion von der Konzentration besteht, liefert das spektralanalytische Ver fahren sehr gute Ergebnisse fr die quantitative Bestimmung. Sorptionsmittel: Cellulose-Fertigplatten (z. B. Merck 10 X 20 cm, Nr. 5730/0050) Schichtdicke: 0,1 mm Fliemittel: Chloroform-Methanol-Wasser (20:70:10) Auftragsmenge: 1--2 fA Detektion: Langwelliges UV-Licht, 360 nm (z. B. Fluotest Universal-Original Hanau) Bei Chromatographie auf Kieselgelplatten, insbesondere wenn Derivate von Aflatoxin Bi nachgewiesen werden .sollen, ist das Fliemittel zweckmigerweise in der Zusammensetzung ab zundern (siehe vorher). ' Eigene Untersuchungen | Als Versuchsmodell wurden 500 ml einer gebruchlichen! JO %igen |\flatoxin Xylit- 0,45 %igen Natriumchlorid-Lsung mit 1 mgjj Bi (Serva Entwicklungslabor Heidelberg) kontami-j1 Abb. 1: UV-Absorptionskurve von Aflatoxin Bi in thanol gemessen niert und in jeweils 50 ml Untersuchungslsung nach Ausschttelung mit Chloroform das Aflatoxin dnnschichtchromatogra phisch bestimmt (siehe unten). Die entwickelten Platten sind lichtgeschtzt aufzubewahren, da die Fluoreszenz der Flecken durch lngere Einwirkung des Tages- bzw. UV-Lichtes abnimmt. Manche Autoren entwickeln deshalb die Dnnschichtplatten im Dunkeln (12). Schon die kontaminierte Lsung zeigte unter langwelligem UV-Licht eine Fluoreszenz, die besser sichtbar war, wenn man ein Stck Filtrierpapier mit einigen Tropfen Untersuchungsl sung befeuchtete. Trotz der vorher besprochenen Instabilitt verhlt sich Afla toxin Bj in wsseriger Lsung gegenber der blichen Sterilisa tion von 20 Minuten bei 120 C resistent. Im Kleinversuch wurde eine Filtration der Untersuchungsl sung ber eine Asbestplatte (50 ml ber Seitz EKS-I-Platte, 5 cm 0 ) vorgenommen, wobei sich herausstellte, da sich das Aflatoxin nur teilweise durch Absorption entfernen lie. Nach vorheriger Kohlebehandlung der verseuchten Infusions lsung und anschlieendef"'FiItfation ber eine EKS-I-Platte, var das Filtrat aflatoxinfrei. . Die Asbestplatten, durch die aflatoxinhaltige Lsungen fil triert werden, zeigen im langwelligen UV-Licht die typische bluliche Fluoreszenz des Aflatoxin Bi. Abb. 2: UV-Absorptionskurve von teilweise zersetztem Aflatoxin B> in thanol gemessen In der Absorptionskurve des vorliegenden Aflatoxin Bj (s. Abb. 1) stimmten die Maxima (268 nm und 365 nm) weitge hend mit den in der Literatur angegebenen Werten (265 nm und 362 nm (2)) berein. Nach dreimaliger Chloroformausschttelung (s. Nachweis), Eindampfen der Auszge auf dem Wasserbad und Aufnahme des Rckstandes in absolutem thanol wurde eine Absorptions kurve erhalten, bei der das erste Maximum geringfgig verscho ben und der erste Peak hher war, als der zweite (s. Abb. 2). Dies ist vermutlich auf eine oxydative Zersetzung des Aflato xins zurckzufhren, zumal der nach der Chloroformausscht telung erhaltene eingedampfte Rckstand rtlich verfrbt war. Die Messung erfolgte mit Zeiss Spektralphotometer PMQ II. Zusammenfassung Fr die Pathogenitt der Aflatoxine beim Menschen liegen zwar noch keine wissenschaftlichen Beweise vor, jedoch mu aus den im Tierversuch gemachten Erfahrungen angenommen werden, da diese hochpotenten Mycotoxine auch den Men schen schdigen. Bei der Herstellung von Infusionslsungen ist deshalb neben der Keim- und Pyrogenfreiheit zustzlich auf eine Abwesenheit von Aflatoxinen zu achten. Bei den Produzenten und Lieferanten liegt die groe Verant wortung fr eine arzneimittelhygienische Herstellung und ein wandfreie Lagerung der Grundstoffe, um Pilzbefall mit nach folgender Mycotoxinbildung auszuschlieen. Rohstoffe, die aus Lndern mit feuchtwarmen Klimaten stammen, sollten mit Nachweis von Aflatoxinen in Xylitlsungen einem Zertifikat geliefert werden, das die Aflatoxinfreiheit be sttigt. Etwa 50 ml einer 10%igen Xylitlsung werden 3mal mit je 30 ml Chloroform ausgeschttelt und die Auszge auf dem Wasserbad auf etwa 1 ml eingedampft, wobei gegebenenfalls eine rtliche Verfrbung auftreten kann. Die Reinheit des Stoffes lt sich ohne groen Aufwand dnnschichtchromatographisch berprfen. Darberhinaus kn nen die bei der Herstellung von Infusionslsungen bentzten Asbestfilter im UV-Licht auf Fluoreszenz untersucht werden. Fr die Bereitung von kohlenhydrathah.^ i- und Aminosu (10) Haussen, E., und G. Hab...orn: Untersuchungen ber Vorkom re-Lsungen empfiehlt sich, die als Konzentrat hei gelsten Substanzen mit Aktivkohle zu behandeln, um eventuelle Verun reinigungen zu entfernen. Unter Beachtung der erwhnten Gesichtspunkte lt sich die men und Wanderung von Aflatoxin Bi und seine Vernderungen bei einigen Icbensmitteltechnologischen Prozessen. Z. Lebens mittel-Unters. u. Forsch. 141, 129 (1969). (11) Haussen, E.: Uber Aflatoxine. Med. u. Ernhr. 12, 249 (1971). 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